JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מפות חמצן תלת-ממדיות כמותיות של גידולי עכברים צולמו באופן לא פולשני באמצעות תהודה פרמגנטית של אלקטרון דופק. אולטרסאונד B-mode ו-Power Doppler שימשו לאנטומיה ולמבנה כלי הדם. תמונות משתי השיטות הונחו על גבי ניתוח גידול רב-פרמטרי.

Abstract

המדידה המדויקת ובזמן אמת של לחץ חלקי של חמצן (pO2) מביאה מידע רב ערך בפתולוגיות רבות, כולל סרטן. pO2 נמוך של הגידול (כלומר, היפוקסיה) קשור לאגרסיביות הגידול ולתגובה לקויה לטיפול. כימות pO2 של הגידול מאפשר להעריך את יעילות הטיפול. הדמיית תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPRI), במיוחד Pulse EPRI, התגלתה כשיטה תלת מימדית (תלת מימדית) מתקדמת להערכת חמצון רקמות in vivo. חידוש זה התאפשר הודות להתפתחויות הטכנולוגיות ב-EPR (תהודה פרמגנטית אלקטרונית) ויישום בדיקות הספין האוקסימטריות המסיסות במים ממשפחת הטריאריל, המציעות נתוני חמצון מהירים ורגישים. זמן ההרפיה של בדיקת הספין (T1 ו/או T2) מספק מידע מדויק על pO2 בווקסלים נבחרים.

גידולי גליובלסטומה LN229 אנושיים גודלו בכרית האופנה הבין-שכמית של עכברים עירומים BALB/c. הדמיית אולטרסאונד (US) שימשה כהתייחסות למידע אנטומי של הגידול. כדי לדמות רקמה pO2, החיות הוצבו במיקום קבוע במיטת החי עם פידוציאלים, מה שאפשר רישום בין שיטות ההדמיה. לאחר מתן חומר הניגוד OX071, בוצע EPRI, ואחריו מצב B בארה"ב. בגלל רעילות בדיקת הספין הנמוכה, ניתן לחזור על ההליך במהלך גידול הגידול או הטיפול. לאחר ההדמיה, תהליך הרישום בוצע באמצעות תוכנה שנכתבה ב-MATLAB. בסופו של דבר, ניתן לחשב את השבר ההיפוקסי עבור גידול ספציפי, ולהשוות את ההיסטוגרמה של התפלגות רקמת pO2 לאורך זמן. EPRI בשילוב אולטרסאונד הוא כלי מצוין למיפוי חמצן של גידולים בסביבה הפרה-קלינית.

Introduction

הבנת המיקרו-סביבה של הגידול (TME), על האינטראקציות המרחביות והדינמיות המורכבות שלה, מביאה להבנה מלאה יותר של הביולוגיה של הגידול. היפוקסיה, או רמות חמצן נמוכות, היא המרכיב העיקרי של TME וממלאת תפקיד קריטי בהתפתחות מצבים מסכני חיים אחרים, כולל מחלות לב וכלי דם, הפרעות מטבוליות כגון סוכרת ומחלת כליות כרונית 1,2,3. חמצון רקמות הוא גורם בסיסי, במיוחד בהקשר של סרטן, שבו לחץ חמצן חלקי ברקמות (pO2) נמצא בקורלציה עם עמידות לטיפול. רמת pO2 העולה על 10 מ"מ כספית קשורה לעלייה ביעילות של רדיותרפיה נמוכה של העברת אנרגיה ליניארית (LET) (אפקט הגברת חמצן).

מחקרים אחרונים המשתמשים בהדמיית תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPRI) הראו כי טיפול בקרינה מונחית חמצן יכול לגרום לשיפור כפול בשיעורי ההישרדות בסוגי סרטן שונים במודלים של עכברים 4,5. זה דומה לנבדקים אנושיים שהגידול שלהם pO2 נמדד במדידות מרובות של אלקטרודות אפנדורף ונמצא שיש להם ערכי pO2 חציוניים או ממוצעים מתחת ל-10 טור6. מלבד רדיותרפיה, היפוקסיה של הגידול נמצאה בקורלציה ישירה עם אגרסיביות הגידול ותוצאות של טיפולים אחרים, כגון טיפול חיסוני 7,8. קשר זה מדגיש את החשיבות של מדידות חמצן מדויקות בשיפור התוצאות הטיפוליות והבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות.

אוקסימטריה אופטימלית in vivo מחייבת מדידה ישירה של לחץ חמצן חלקי ברקמות ללא תלות בגורמים כמו זלוף רקמות וריווי המוגלובין. ההליך צריך להיות לא פולשני, עם זמן הדמיה קצר ומדויק כדי למנוע השפעות אפשריות על האורגניזם, כגון הרדמה ממושכת, שינויים בטמפרטורת הרקמה או שינויים משמעותיים בלחץ הרקמות וב-pH. אוקסימטריית רקמות צריכה להפגין דיוק ואמינות גבוהים, ולהבטיח מדידות עקביות ללא קשר לשינויים במיקרו-סביבת הרקמה, כולל הבדלים ב-pH ובמצב חמצון חיזור. לתכנון טיפול יעיל, שחזור נתוני תמונה בזמן אמת ופרשנות פשוטה הם קריטיים. זה כרוך לא רק בהשגת רזולוציה מרחבית, רצוי פחות מ-1 מ"מ, אלא גם לאפשר איסוף נתונים מהיר כדי לנטר שינויים דינמיים במצב החמצן ברקמות, כגון היפוקסיה מחזורית.

בהקשר זה פותחו טכניקות שונות למדידת חמצן מולקולרי או להערכת היפוקסיה, שלכל אחת מהן ישימות ויתרונות ייחודיים. אלקטרודת הפלטינה, הנחשבת ל"תקן הזהב" לאוקסימטריה של רקמות תאים ובעלי חיים חיים, מציעה מדידות עקביות באמצעות החדרה מדויקת לרקמות. גישות אחרות, כגון שיטות אופטיות המשתמשות בבדיקות פלואורסצנטיות, פוטואקוסטיקה, ניטור השפעות היפוקסיה באמצעות ביטוי גנים או חלבונים, או מבחני שביט, קלות לשימוש אך הן עקיפות או מוגבלות על ידי נתיב אופטי ברקמות. נראה כי חלופות מבטיחות להערכת היפוקסיה ו/או חמצון הן הדמיית תהודה מגנטית (MRI)-OE-MRI10 - או נייד11, טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) עם בדיקות רגישות להיפוקסיהשונות 12, או תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPR).

ל-EPR יש היסטוריה ארוכה בתחום הביו-רפואה. התופעה עצמה דווחה לראשונה בשנת 1944 ואומצה באופן נרחב ככלי לניתוח מבנים כימיים ולאחרונה, עבור מערכות ביולוגיות וחומרים עם אלקטרונים לא מזווגים13. ספקטרוסקופיה EPR שימשה לחקר הדינמיקה והמבנה של מערכות ביולוגיות כגון פוטוסינתזה, מטאלופרוטאינים, אנזימים רדיקליים וממברנות פוספוליפידים 14,15,16. ספקטרוסקופיה וטומוגרפיה של תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPR) התגלו כשיטות לא פולשניות מרכזיות לחקר חמצון גידול ומיקרו-סביבה ברזולוציה מרחבית של ~1 מ"מ, רזולוציה זמנית של 1-10 דקות ורזולוציית pO2 של 1-3 טור 5,17,18.

שיטות EPR של גל רציף (CW) נשארות בשימוש נרחב ברוב היישומים בשל הפשטות של הקלטה ופרשנות ספקטרום. אינטראקציות בדיקת החמצן-ספין פועלות על ידי הערכת שינויים בעוצמת אות ה-EPR או בצורת הקו, ומספקות תובנות לגבי רמות החמצן בתוך הדגימה. ל-CW EPR יש יתרון בולט ברגישות לטווח רחב יותר של pO2 בהשוואה לשיטות פולסים. על ידי יישום רצפי פולסים שונים, ניתן להבהיר מידע כגון זמני הרפיה של ספין-ספין אלקטרונים, זמני הרפיה של ספין-סריג ואינטראקציות עם ספינים שכנים18,19. טכניקות EPR דופק, כגון התאוששות היפוך עם קריאת הד ספין אלקטרונים (IRESE), מודדות את שיעורי הרפיית סריג הספין, תוך הימנעות מהרפיה של החפץ הנגרמת על ידי הרפיית בדיקת ספין-ספין בריכוזי חמצן נמוכים19,20. ניתן להשתמש ב-EPR כדי לנטר שינויים בריכוז החמצן ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה; עם זאת, באוקסימטריה בריכוזי חמצן גבוהים, דופק EPR מתמודד עם מגבלות עקב זמני ההרפיה הקצרים של מגנטיזציה רוחבית הנמדדת עם הד ספין אלקטרונים (ESE). בסופו של דבר, CW ו-EPR דופק משלימים זה את זה, והבנה אמינה של מערכת הספין דורשת יישום של שתי השיטות.

טכניקות אוקסימטריית EPR מסתמכות על הקשר הליניארי בין רמות החמצן לסריג הספין-ספין וכן על שיעורי הרפיית ספין-ספין בתמיסה. כל הבדיקות האוקסימטריות מחולקות לרוב לשני סוגים: בדיקות ספין מסיסות וחלקיקים. בחירת בדיקת הספין הנכונה תלויה במערך הניסוי ובמידע הדרוש 21,22,23. בדיקות ספין מסיסות, כגון ניטרוקסידים או נגזרות הטריטיל24,25 כגון OX063 וצורתו המפוזרת OX071, המופצות בכל הרקמה, מספקות מידע מכל הנפח. לחלופין, למדידה חד-נקודתית, ולהערכות חמצן ממושכות וחוזרות, ניתן להשתמש בבדיקות מצב מוצק כמו LiPc, LiBuO או נגזרות פחמן (ראה טבלה 1)22,23,26.

הדמיית אולטרסאונד במצב B נמצאת בשימוש נרחב במרפאה להדמיית רקמות רכות. הרזולוציה תלויה בתדר המתמר בו נעשה שימוש, ועבור מחקרים פרה-קליניים, 18 מגה-הרץ ומעלה מספקים רזולוציה מספקת במישור ובעומק התמונה. יתרון נוסף של אולטרסאונד הוא האפשרות להשיג תמונות כלי דם פונקציונליות באמצעות מצב Power Doppler. כאן, אנו מציגים הדמיית חמצן בתהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPROI) כשיטה ליצירת מפות חמצן תלת מימדיות של גידולים בעכברים חיים. אולטרסאונד מתאים מאפשר את ההתייחסות האנטומית הדרושה להגדרת הגידול בתוך EPROI. מפגשי הדמיה מרובים אפשריים לכל בעל חיים. השלב האחרון הוא הניתוח, כולל שחזור תמונה ורישום בין השיטות לקבלת היסטוגרמה pO2 מנפח הגידול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

העכברים נלקחו ממתקן גידול בעלי חיים מאושר וכל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות האתיות (במקרה שלנו - אישור מס' 165/2023, ועדת האתיקה המקומית הראשונה, קרקוב, פולין).

1. בעלי חיים וקו גידול

הערה: העכברים שוכנו בתנאי מעבדה סטנדרטיים: בהיר/כהה: 12 שעות/12 שעות, לחות: 60%, טמפרטורה: 23 מעלות צלזיוס. הם קיבלו דיאטת צ'או סטנדרטית עם גישה חופשית למי שתייה בכלובים קהילתיים.

  1. תרבית קו תאים עכברי גליובלסטומה מולטיפורמה LN229
    1. תרבית תאי LN229 בצלוחיות תרבית רקמה בגודל 25 ס"מ2 במדיום DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין בריכוזים של 10 U/mL ו-0.1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה.
    2. שמור על תאים באווירה לחה המכילה 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס, העוברים כל 48 שעות באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA ו-PBS ללא יוני מגנזיום וסידן (pH 7.4).
  2. חיסון נגד גידולים
    1. שבוע לפני החיסון, טפל בעכברים מדי יום כדי להכיר להם את החוקר.
    2. ביום החיסון, שקלו עכברים.
    3. השעו 200,000 תאי LN229 ב-50 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית ללא גורמי גדילה. בעזרת מחט של 29 גרם, יש לחסן את תערובת התאים באופן תת עורי לתוך כרית השומן התוך-שכמה של עכברים עירומים בני 16 שבועות (N = 5).

2. הדמיית דופלר US

ציר הזמן הכולל של הדמיית הגידול מוצג באיור 1. הדמיית אולטרסאונד משמשת הן להדמיית כלי דם על ידי דופלר US והן על ידי Anatomy US כהתייחסות ממש לפני EPROI (איור 2). הדמיה אנטומית במצב B חיונית לניתוח חמצון גידול על ידי EPR ומתוארת בסעיף 3. בעוד שהדמיית אולטרסאונד דופלר (סעיף 2) אינה חובה לביצוע רישום מוצלח, היא בכל זאת מספקת מידע רב ערך על חלון הזמן האופטימלי למחקר EPR ומאפשרת קביעת כלי דם פעילים באזור הגידול.

  1. הכנת עכבר
    1. המתן עד שהגידולים יגיעו לסביבות 30 מ"מ3. במידת הצורך, גלחו את העכברים באופן ידני סביב אתר הגידול.
    2. לגרום להרדמה באמצעות 2% איזופלורן ולשמור עליה עם 1-1.5% איזופלורן.
    3. העבירו את בעל החיים מתא ההרדמה לכרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס במהלך ההכנה (בהתבסס על בדיקת טמפרטורת פי הטבעת). ייצב את טמפרטורת החיה כדי לקבל משוב פרמטרי פיזיולוגי מתאים.
  2. אולטרסאונד
    1. השתמש במערכת האולטרסאונד עם מתמר MHz 57-25 עבור הדמיה פרה-קלינית (איור 2, שלב 1).
    2. לרכוש מדידות תלת מימד במצב B להדמיית מורפולוגיה של גידול בכיוון סגיטלי. השתמש בגודל מדרגה של 0.1 מ"מ.
      הערה: אין להזיז את החיה או את המתמר כדי לשמור על אותן הגדרות בדיוק.
    3. השתמש במצב Power Doppler כדי לדמיין כלי דם גידול פונקציונליים עם הפרמטרים הבאים: מהירות: 1.5 קילו-הרץ, מסנן קיר: נמוך, עדיפות: 75%, התמדה: בינונית, גודל צעד 0.10 מ"מ.
    4. סובב את המתמר כדי לחזור על שלבים 2.2.2 ו-2.2.3 בכיוון צירי.
    5. בצע ניתוח נתונים באמצעות התוכנה המסופקת על ידי יצרן האולטרסאונד. סמן את גבול הגידול, העלה אותו לתמונה תלת מימדית וחשב את נפח הגידול ואת אחוז כלי הדם.

3. אפרוי

  1. הכנת בדיקה
    1. ממיסים אבקת OX071 המאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס בהזרקה H2O לריכוז סופי של 1 גרם/10 מ"ל (~70 מ"מ).
  2. הכנת עכבר
    1. הרדמו את העכברים עם 1%-3% איזופלורן מעורבב עם אוויר החדר והניחו אותם על מחזיק בעל חיים.
    2. יש לתת 1 מ"ל של מי מלח פיזיולוגיים תת עוריים כדי לשמור על רמת הידרציה נאותה.
    3. עקוב אחר קצב הנשימה של בעל החיים (80 ± 20 פעימות לדקה) והטמפרטורה (37 ± 1 מעלות צלזיוס) באמצעות חיישן כרית נשימה ומדחום משטח המחובר לעור העכבר. עקוב אחר טמפרטורת פי הטבעת כנקודת ייחוס (37 מעלות צלזיוס ± 1 מעלות צלזיוס).
    4. הכנס צינורות פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) (קוטר חיצוני של 0.7 מ"מ) תוך צפקי למתן בדיקת ספין. אבטח את הצינורית באמצעות ויניל פוליסילוקסן (VPS) כדי למנוע את נפילתה מחלל הבטן.
    5. הכנס קטטר שתן (24 גרם) כדי לאסוף את בדיקת הספין המופרש.
    6. אבטחו את העכבר במיטת חיה באמצעות חימר דנטלי VPS לקיבוע (איור 2A).
  3. הדמיה אנטומית US לרישום
    1. הפעילו את השולחן הנשלט בתלת-ממד ואת המיטה הישרה. הגדר את טמפרטורת הפלטפורמה ל-60 מעלות צלזיוס כך שטמפרטורת החיה המבודדת על ידי מחזיק מיטת הפלסטיק תישמר על 37 מעלות צלזיוס.
    2. הניחו את מיטת החיה עם החיה המשותקת במחזיק המיטה והעבירו אותה לשולחן מבוקר תלת-ממד להדמיה אנטומית לפני מדידת EPR (איור 2B). ודא שהחיה מאובטחת בתוך מחזיק המיטה ואינה נוגעת בפלטפורמת החימום.
    3. תקן את מיקום מחזיק המיטה בתלת מימד כדי למנוע סיבוב, במיוחד סיבוב XZ (מישור סגיטלי), שהוא חיוני לרישום מדויק.
    4. הניחו סמן מיקום (חוט דיג על הקלטת, קוטר 0.35 מ"מ) על מחזיק המיטה, ומסמנים את תחילת התהודה.
    5. בצע הדמיה במצב B באופן ידני עם צעד של 1 מ"מ בכיוונים ציריים וסגיטליים לכיוון ציר Y.
    6. דמיין את מבנה הגידול עם הפרמטרים הבאים התלויים בתדר המתמר הספציפי; עבור מתמר 18 מגה-הרץ, עומק 20 מ"מ, טווח דינמי 84 dB, הספק 8 dB, רווח 80%; עבור מתמר 40 מגה-הרץ, עומק 20 מ"מ, טווח דינמי 32 dB, רווח של 100%; עבור מתמר 57 מגה-הרץ, עומק 13 מ"מ, רווח 6 dB, הספק 100%. התאם את ההגדרה על מיקוד המתמר בהתאם למיקום הגידול המסוים.
    7. בתום ההדמיה האנטומית יש לנגב את עודפי הג'ל מהעכבר ולהוציא את העכבר המשותק במיטת החי ממחזיק המיטה.
  4. הדמיית חמצן EPR
    1. השתמש בהדמיית החמצן עבור Pulse EPR, הפועל בתדרי רדיו הנעים בין 685 מגה-הרץ ל-735 מגה-הרץ. להתקנה, השתמש בסלילי אופסט להדמיה תלת מימדית וניתוח זמני הרפיה. השתמש בתהודה אופקית בגודל 32 מ"מ על 35 מ'.
    2. העבירו את העכבר המשותק במיטת החיה מיד להדמיית EPR אחרי אולטרסאונד אנטומי (איור 2C). שמור על מיקום מיטת החי בזהירות כדי למזער סיבובים בתוך התהודה, בדומה להליך המתואר בסעיף 3.3.
    3. חבר מחדש את בדיקת הטמפרטורה כדי להבטיח ניטור ותחזוקה רציפים של טמפרטורת החיה, תוך התאמה לטמפרטורה בתוך התהודה.
    4. בתוכנת ספקטרומטר EPR, בצע כוונון מהוד על ידי שימוש בגלגל הכוונון כדי למרכז את התדר סביב MHz 725 (איור 3A).
      הערה: מהוד מותאם היטב צריך להיות בעל טבילה של 25 dB ומעלה.
    5. מטב את הספק המיקרוגל כדי להשיג שיא ב-60 ns (איור 3B) על ידי התאמת ערך ההנחתה מ-20 dB ל-3 dB.
    6. כוונו את המכשיר כך שדעיכת האינדוקציה החופשית (FID) של פידוציאלים הממוקמים בתוך מיטת החיה מרוכזת בשדה המגנטי ומדורגת בשלבים (איור 3C).
    7. יש לתת 100 מיקרוליטר של OXO71 תוך צפקי דרך הצינורית שהוכנסה קודם לכן, ולאחר מכן שטיפה עם 50-100 מיקרוליטר של תמיסת מלח.
    8. באמצעות רצף תורים מתוכנת, רכוש מדידות עם פרמטרים מוגדרים; רצף טיפוסי מכיל זמני הרפיה T1, T2, 3D Electron Spin Echo (ESE) עבור תמונות נאמנות ו-4D Inversion Recovery Electron Spin Echo (IRESE) עבור תמונת החיה. אסוף את הדמיית ה-IRESE עם שיפוע של 1.5 גרם/ס"מ, זמן חזרה של 55 מיקרון, הפעלה מוקדמת -250 ns, t90 הוא 60 ns ו-tau 400 ns; זמן רכישה כולל ~ 12 דקות. חזור על הדמיית IRESE לפחות למשך 30-40 דקות (3-4x) לאחר הזרקת הבדיקה.
    9. לאחר ההדמיה, העבירו את העכבר ממיטת החי לכרית החימום. יש לתת 1 מ"ל של מי מלח פיזיולוגיים תת עוריים כדי לשמור על רמת הידרציה נאותה. עקוב עד שהעכבר ישחזר תנועה זקופה.

4. ניתוח נתונים

  1. ניתוח שחזור 4D ב-"ProcessGUI"
    1. לפני השחזור, החל תיקון בסיסי על התחזיות על ידי בחירת תרחיש "PulseRecon.scn" וטעינת קובץ הפרמטרים "IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par" כדי לנתח נתונים גולמיים של IRESE.
    2. סנן כל הקרנה עם מסנן גאוס ברוחב של 4 נקודות, הגדרת ברירת מחדל עבור התרחיש שנבחר.
    3. דגימת משנה של ההקרנות המסוננות ל-64 נקודות (גודל מטריצה), הגדרת ברירת מחדל לתרחיש שנבחר.
    4. סנן עוד יותר את ההקרנות עם מסנן Ram-Lak עם אפודיזציה פי 0.6 מתדר Nyquist (לחץ על פרמטר שחזור | FilterCutOff).
    5. הקרנה לאחור של ההקרנות המסוננות כדי לייצר תמונה ספקטרלית-מרחבית 4D.
    6. השתמש באלגוריתם מתאים כדי לחלץ את רוחב קו מנות הספין מהספקטרום בכל ווקסל. הגדרת פרמטרי התאמת סעיף: מאריך נקודה אחרונה - 3, שיטת התאמה - ברירת מחדל.
    7. השתמש בהגדרות ברירת המחדל עבור פרמטרים בהליך ההתאמה, כולל משרעת הספקטרום, הפאזה, המרכז הספקטרלי ורוחב קו מנת הספין הספקטרלי.
  2. רישום בין US אנטומי ל-EPROI ב-"ArbuzGUI" (איור 4)
    הערה: נוהל "ArbuzGUI" MATLAB שפותח על ידי בוריס אפל מאוניברסיטת שיקגו שימש לביצוע הרישום. התוכנה זמינה ב-EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit. ארגז הכלים לרישום הוסבר בעבר במקוםאחר 27. עיין במדריך למשתמש לקבלת הוראות מפורטות שלבאחר שלב 28.
    1. טען תמונות ארה"ב דו-ממדיות כערימה עם צעד של 1 מ"מ (השלב קשור אך ורק לרכישת מסגרת בהדמיה במצב B, נקודה 3.3.7) כדי ליצור תמונות תלת מימד בארה"ב.
    2. הוסף תמונות pO2 שנאספו (שוחזרו בשלב 4.1) כסוג תמונה תלת-ממדית שהוגדר כנתוני "PO2_pEPRI". אחסון נתונים בפרוייקט.
    3. יצירת רצף רישום ושינוי צורה על-ידי בחירה באפשרות מיוחד | רישום MRI-EPRI.
    4. בחר את התמונה שיש להתאים לנתוני EPRI (לדוגמה, US axial 3D) על-ידי בחירה ב-Sequence | add action. השתמש בשלב 5:T2 לקבלת הביצועים הטובים ביותר. בתוצאה, יופיע סמל פלוס שחור לפני שם התמונה שנבחרה.
    5. פתח את התמונה האמריקאית ב- SliceMaskEditPLG. התאם את קנה המידה של התמונה האמריקאית על סמך הסרגל המוצג בתמונות. סמן סמן מיקום US, מתאר בעלי חיים ומיקום הגידול על סמך מסגרות נבחרות.
    6. ב-SliceMaskEditPLG, סמן את מתאר מפת pO2 ו-fiducial בתמונות 4D pO2 משוחזרות.
    7. באמצעות מציג האיורים וארגז הכלים RotateImagePLG, סובב את התמונה האמריקאית בהתאם לסמן המיקום בארה"ב לעומת מיקומים נאמנים כדי לרשום מפת pO2 עם מתאר ארה"ב.
    8. הפוך את מסכת הגידול מתמונת ארה"ב למפת pO2 .
    9. דמיין את מסכת הגידול במפת pO2 של העכבר וייצא ערכי pO2 עבור כל ווקסל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

חתך מייצג מתמונת האולטרסאונד של גידול LN229 הגדל בכרית השומן התוך-שכמה, יחד עם כלי הדם מוצג באיור 5. כלי דם מסוימים נראים מחוץ לגבול הגידול. באופן בלתי צפוי, אחוז נפח כלי הדם של הגידול לא ירד ונשאר יציב עם צמיחת הגידול.

כפי שמתואר באי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול ההדמיה המתואר. ראשית, כדי לרשום את תמונות האנטומיה עם מפות החמצן, MRI עשוי להיות בחירה טובה יותר מאשר אולטרסאונד בשל רזולוציה טובה יותר והיכולת לספק נתוני תלת מימד מפורטים19. אולטרסאונד עם מתמר בתדר גבוה מספק רזולוציה מצוינת ו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

פרופ' ה. הלפרן וב. אפל הם מייסדי O2M Technologies. למחברים האחרים: ג. דז'יורמן, א. ביניה, א. מורזין, ב. פלוצ'יניק, י. קוז'יק, ג. שבצ'יק, מ. שצ'יגייל, מ. קז'יקבסקה-סרדה ומ. אלאס, אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

אנו מודים ל-O2M Technology על התמיכה הטכנית האדיבה. מענקי המרכז הלאומי למדע של פולין מס' 2020/37/B/NZ4/01313 (מצלמת Jiva-25) ו-NCBiR: ENM3/IV/18/RXnanoBRAIN/2022 (עלויות בעלי חיים) מוכרים. רכישת אולטרסאונד VevoF2 נתמכה על ידי הפקולטה לביוכימיה, ביופיזיקה וביוטכנולוגיה במסגרת יוזמת המצוינות בתוכנית האסטרטגית באוניברסיטת ג'גילוניאן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
aqua pro injectionePolpharma1280610-
ArbuzGUI O2M Technologies-accesible in the github repository
disodium phosphatePOCH S.A.799280115-
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucoseMerck Life ScienceD56484500 mg/L glucose and L-glutamine
fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific10500064-
fishing wireGood FishA-55A-035US position marker - 0.35 mm
GeltrexGibco, Thermo Fisher ScientificA1413302reduced growth factor basement membrane matrix
ibGUIO2M Technologies-accesible in the github repository
injectio natrii chlorati isotonicaPolpharmamultipe items were used9 mg/mL
insulin needles 29 G Becton, Dickinson and Companymultipe items were used-
Jiva 25O2M Technologies-EPROI
MATLABMathWorks-version R2021b
penicillin-streptomycinMerck Life ScienceP4333with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
potassium chloridePOCH S.A.739740114-
potassium dihydrogen phosphatePOCH S.A.742020112-
ProcessGUIO2M Technologies-accesible in the github repository
PTFE tubing Cole Palmer Instrument Co06412-11-
sodium chloridePOCH S.A.794121116-
SpecMan4EPRFEMI Instruments-version 3.4 CS 64bit
Surflash I.V. CatheterTerumoSR*FF2419size: 24G x ¾"
tape3M multipe items were usedmicropore
Trypsin-EDTA Gibco, Thermo Fisher Scientific25200072-
UltrasonographyTelemed-Anatomical US
US gelKONIXNUG-0019-
VetfluraneVirbac1373171000 mg/g
Vevo F2FujiFilms, Visual Sonics-B-mode and Doppler
vinyl polysiloxane dental clay 3M ESPEmultiple items were used-

References

  1. Chen, P. -S. Pathophysiological implications of hypoxia in human diseases. J Biomed Sci. 27, 63(2020).
  2. Lopez-Pascual, A., Trayhurn, P., Martínez, J. A., González-Muniesa, P. Oxygen in metabolic dysfunction and its therapeutic relevance. Antioxid Redox Signal. 35 (8), 642-687 (2021).
  3. Vaupel, P., Mayer, A., Höckel, M. Tumor hypoxia and malignant progression. Methods Enzymol. 381, 335-354 (2004).
  4. Gertsenshteyn, I., et al. Absolute oxygen-guided radiation therapy improves tumor control in three preclinical tumor models. Front Med (Lausanne). 10, 1269689(2023).
  5. Epel, B., et al. Oxygen-guided radiation therapy. Int J of Radiat Oncol Biol Phys. 103 (3), 977-984 (2019).
  6. Hockel, M., et al. Association between tumor hypoxia and malignant progression in advanced cancer of the uterine cervix. Cancer Res. 56 (19), 4509-4515 (1996).
  7. Semenza, G. L. Intratumoral hypoxia and mechanisms of immune evasion mediated by hypoxia-inducible factors. Physiology (Bethesda). 36 (2), 73-83 (2021).
  8. Dewhirst, M. W., Mowery, Y. M., Mitchell, J. B., Cherukuri, M. K., Secomb, T. W. Rationale for hypoxia assessment and amelioration for precision therapy and immunotherapy studies. J Clin Invest. 129 (2), 489-491 (2019).
  9. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  10. O'Connor, J. P. B., et al. Oxygen-enhanced MRI accurately identifies, quantifies, and maps tumor hypoxia in preclinical cancer models. Cancer Res. 76 (4), 787-795 (2016).
  11. Colliez, F., et al. Oxygen mapping within healthy and acutely infarcted brain tissue in humans using the NMR relaxation of lipids: A proof-of-concept translational study. PLoS One. 10 (8), e0135248(2015).
  12. Gouel, P., et al. Advances in PET and MRI imaging of tumor hypoxia. Front Med (Lausanne). 10, 1055062(2023).
  13. Płonka, P. M. Paramagnetomics. Electron Spin Resonance Spectroscopy in Medicine. , 189-221 (2019).
  14. Kavetskyy, T. S., et al. EPR study of self-organized magnetic nanoparticles in biomaterials. Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. 25, 146-156 (2022).
  15. Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR Imaging and in Vivo EPR. , CRC Press. (2018).
  16. Berliner, L. J. The evolution of biomedical EPR (ESR). Biomed Spectrosc Imaging. 5 (1), 5-26 (2017).
  17. Matsumoto, K. -I., et al. EPR-based oximetric imaging: a combination of single point-based spatial encoding and T1 weighting. Magn Reson Med. 80 (5), 2275-2287 (2018).
  18. Kishimoto, S., et al. Pulsed electron paramagnetic resonance imaging: Applications in the studies of tumor physiology. Antioxid Redox Signal. 28 (5), 1378-1393 (2018).
  19. Epel, B., Halpern, H. J. In vivo pO2 imaging of tumors: Oxymetry with very low-frequency electron paramagnetic resonance. Methods Enzymol. 564, 501-527 (2015).
  20. Epel, B., et al. Absolute oxygen R1e imaging in vivo with pulse electron paramagnetic resonance. Magn Reason Med. 72 (2), 362-368 (2014).
  21. Ahmad, R., Kuppusamy, P. Theory, instrumentation, and applications of electron paramagnetic resonance oximetry. Chem Rev. 110 (5), 3212-3236 (2010).
  22. Kuppusamy, P. Sense and sensibility of oxygen in pathophysiology using EPR oximetry. Measuring oxidants and oxidative stress in biological systems. Berliner, L. J., Parinandi, N. L. , Springer. Cham (CH). (2020).
  23. Flood, A. B., Satinsky, V. A., Swartz, H. M. Comparing the effectiveness of methods to measure oxygen in tissues for prognosis and treatment of cancer. Adv Exp Med Biol. 923, 113-120 (2016).
  24. Ardenkjær-Larsen, J. H., et al. EPR and DNP properties of certain novel single electron contrast agents intended for oximetric imaging. J Magn Reason. 133, 1-12 (1998).
  25. Reddy, T. J., Iwama, T., Halpern, H. J., Rawal, V. H. General synthesis of persistent trityl radicals for EPR imaging of biological systems. J Org Chem. 67 (14), 4635-4639 (2002).
  26. Kmiec, M. M., Tse, D., Kuppusamy, P. Oxygen-sensing paramagnetic probes for clinical oximetry. Adv Exp Med Biol. 1269, 259-263 (2021).
  27. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  28. O2M Technologies LLC. JIVA-25 Oxygen Imager User Manual. , (2024).
  29. Epel, B., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen imaging of a rabbit tumor using localized spin probe delivery. Med Phys. 37 (6 Part1), 2553-2559 (2010).
  30. Epel, B., Viswakarma, N., Sundramoorthy, S. V., Pawar, N. J., Kotecha, M. Oxygen imaging of a rabbit tumor using a human-sized pulse electron paramagnetic resonance imager. Mol Imaging Biol. 26 (3), 403-410 (2023).
  31. Epel, B., Redler, G., Tormyshev, V., Halpern, H. J. Towards human oxygen images with electron paramagnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 876, 363-369 (2016).
  32. Elas, M., et al. EPR oxygen images predict tumor control by a 50% tumor control radiation Dose. Cancer Res. 73 (17), 5328-5335 (2013).
  33. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen images correlate spatially and quantitatively with Oxylite oxygen measurements. Clin Cancer Res. 12 (14), 4209-4217 (2006).
  34. Redler, G., Epel, B., Halpern, H. J. Principal component analysis enhances SNR for dynamic electron paramagnetic resonance oxygen imaging of cycling hypoxia in vivo. Magn Reson Med. 71 (1), 440-450 (2014).
  35. Naz, S., Kishimoto, S., Mitchell, J. B., Krishna, M. C. Imaging metabolic processes to predict radiation responses. Semin Radiat Oncol. 29 (1), 81-89 (2019).
  36. Yamamoto, K., et al. Molecular imaging of the tumor microenvironment reveals the relationship between tumor oxygenation, glucose uptake, and glycolysis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 80 (11), 2087-2093 (2020).
  37. Kawai, T., et al. Continuous monitoring of postirradiation reoxygenation and cycling hypoxia using electron paramagnetic resonance imaging. NMR Biomed. 35 (10), e4783(2022).
  38. Takakusagi, Y., et al. Pyruvate induces transient tumor hypoxia by enhancing mitochondrial oxygen consumption and potentiates the anti-tumor effect of a hypoxia-activated prodrug TH-302. PLoS One. 9 (9), e107995(2014).
  39. Li, T., et al. Evaluations of an early change in tumor pathophysiology in response to radiotherapy with oxygen enhanced electron paramagnetic resonance imaging (OE EPRI). Mol Imaging Biol. 26 (3), 448-458 (2024).
  40. Schaner, P. E., et al. First-in-human study in cancer patients establishing the feasibility of oxygen measurements in tumors using electron paramagnetic resonance with the OxyChip. Front Oncol. 11, 743256(2021).
  41. Swartz, H. M., et al. How best to interpret measures of levels of oxygen in tissues to make them effective clinical tools for care of patients with cancer and other oxygen-dependent pathologies. Physiol Rep. 8 (15), 14541(2020).
  42. Tseytlin, M., et al. A combined positron emission tomography (PET)-electron paramagnetic resonance imaging (EPRI) system: initial evaluation of a prototype scanner. Phys Med Biol. 63 (10), 105010(2018).
  43. Kim, H., et al. Development of a PET/EPRI combined imaging system for assessing tumor hypoxia. J Instrum. 16 (03), P03031(2021).
  44. Shen, J., et al. Development of isoindoline nitroxides for EPR oximetry in viable systems. Appl Magn Reason. 22, 357-368 (2002).
  45. Alecci, M., Ferrari, M., Quaresima, V., Sotgiu, A., Ursini, C. L. Simultaneous 280 MHz EPR imaging of rat organs during nitroxide free radical clearance. Biophys J. 67 (3), 1274-1279 (1994).
  46. Hyde, J. S., Subczynski, W. K. Simulation of ESR spectra of the oxygen-sensitive spin-label probe CTPO. J Magn Reson (1969). 56 (1), 125-130 (1984).
  47. Sarna, T., Dulȩba, A., Korytowski, W., Swartz, H. Interaction of melanin with oxygen. Arch Biochem Biophys. 200 (1), 140-148 (1980).
  48. Bratasz, A., Kulkarni, A. C., Kuppusamy, P. A highly sensitive biocompatible spin probe for imaging of oxygen concentration in tissues. Biophys J. 92 (8), 2918-2925 (2007).
  49. Gluth, T. D., et al. Biocompatible monophosphonated trityl spin probe, HOPE71, for in vivo measurement of pO2, pH, and [Pi] by electron paramagnetic resonance spectroscopy. Anal Chem. 92 (2), 946-954 (2022).
  50. Gluth, T. D., et al. Large-scale synthesis of a monophosphonated tetrathiatriarylmethyl spin probe for concurrent in vivo measurement of pO2, pH and inorganic phosphate by EPR. RSC Adv. 11 (42), 25951-25954 (2022).
  51. Vahidi, N., et al. In vivo and in vitro EPR oximetry with fusinite: A new coal-derived, particulate EPR probe. Magn Reson Med. 31 (2), 139-146 (1994).
  52. Gallez, B., et al. Small particles of fusinite and carbohydrate chars coated with aqueous soluble polymers: preparation and applications for in vivo EPR oximetry. Magn Reson Med. 40 (1), 152-159 (1998).
  53. James, P. E., et al. Gloxy: An oxygen-sensitive coal for accurate measurement of low oxygen tensions in biological systems. Magn Reson Med. 38 (1), 48-58 (1997).
  54. Goda, F., et al. In vivo oximetry using EPR and India ink. Magn Reson Med. 33 (2), 237-245 (1995).
  55. Liu, K. J., et al. Lithium phthalocyanine: a probe for electron paramagnetic resonance oximetry in viable biological systems. Proc Natl Acad Sci. USA. 90 (12), 5438-5442 (1993).
  56. Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Mechanism of oxygen-induced EPR line broadening in lithium phthalocyanine microcrystals. J Magn Reason. 170 (1), 42-48 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

216PO2EPRIOX071

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved