סטנדרטיזציה של תוכנה חצי-אוטומטית חדשנית למדידת צמיחת עצבים

Summary

מבחני צמיחת עצבים מספקים ערך כמותי על תהליכים עצביים רגנרטיביים. היתרון של תוכנה חצי אוטומטית זו הוא שהיא מחלקת גופי תאים ונוירוטים בנפרד על ידי יצירת מסכה ומודדת פרמטרים שונים כגון אורך נוירוט, מספר נקודות הסתעפות, שטח אשכול תא-גוף ומספר אשכולות תאים.

Abstract

טכניקות הדמיה חיה יעילות הן חיוניות להערכת המורפולוגיה העצבית על מנת למדוד את צמיחת הנוירוטים בזמן אמת. מדידה נכונה של צמיחת נוירוטים הייתה אתגר ארוך שנים לאורך השנים בתחום המחקר במדעי המוח. פרמטר זה משמש אבן פינה במערכים רבים של ניסויים במבחנה , החל מתרביות מנותקות ותרביות אורגנוטיפיות ועד קווי תאים. על ידי כימות אורך הנוריט, ניתן לקבוע אם טיפול מסוים עבד או אם התחדשות אקסונלית משופרת בקבוצות ניסוי שונות. במחקר זה, המטרה היא להדגים את החוסן והדיוק של תוכנת Incucyte Neurotrack neurite outgrowth analysis. תוכנה חצי-אוטומטית זו זמינה במערכת מיקרוסקופיה בהילוך מהיר המציעה מספר יתרונות על פני מתודולוגיות נפוצות בכימות אורך העצב בתמונות ניגודיות פאזה. האלגוריתם מסווה ומכמת מספר פרמטרים בכל תמונה ומחזיר מדדים של תאים עצביים, כולל אורך נוירוט, נקודות הסתעפות, אשכולות תא-גוף ואזורי אשכול תא-גוף. ראשית, אימתנו את החוסן והדיוק של התוכנה על ידי התאמה בין הערכים שלה לאלה של NeuronJ הידני, תוסף פיג'י. שנית, השתמשנו באלגוריתם שמסוגל לעבוד גם על תמונות ניגודיות פאזה וגם על תמונות אימונוציטוכימיות. באמצעות סמנים עצביים ספציפיים, תיקפנו את ההיתכנות של ניתוח צמיחת עצבים מבוסס פלואורסצנטיות על נוירונים חושיים בתרביות מבחנה . בנוסף, תוכנה זו יכולה למדוד אורך עצבי על פני תנאי זריעה שונים, החל מתאים בודדים ועד רשתות עצביות מורכבות. לסיכום, התוכנה מספקת פלטפורמה חדשנית וחסכונית בזמן למבחני צמיחת נוירונים, וסוללת את הדרך לכימות מהיר ואמין יותר.

Introduction

בעצבים סיאטיים, ניתן למדוד התחדשות אקסונלית¹. בנוסף, מחקרי מבחנה הראו את ההיתכנות של ניטור צמיחה אקסונלית ^2,3 כדי להבין את השלבים השונים שלה, מהנבטה אקסונלית לניוון אקסונלי, הן בנוירונים בריאים והן בתאי עצב פגועים. על ידי מעקב אחר תהליכים אלה, ניתן למדוד פרמטרים כגון קוטביות אקסונלית, חניכה, יציבות והסתעפות. הפרמטר האחרון הוא קריטי להבנת תפיסת כאב נוירופתית ^4,5,6. באופן דומה, ניוון אקסונלי יכול להיות מנוטר in vivo⁷ ....

Protocol

1. סריקת הכלי במכונה

הערה: הזיהוי מתבצע על ידי מצלמת Basler Ace 1920-155 מיקרומטר מובנית.

1. פתח את התוכנית על-ידי לחיצה על התחבר להתקן ובחירה באפשרות תזמון - כדי לרכוש. לאחר מכן לחץ על הסימן + .
2. ציין אם הספינה תיסרק שוב ושוב או רק פעם אחת על ידי בחירה באפשרות סרוק בלוח הזמנים או סרוק פעם אחת, בהתאמה.
3. בחר חדש כדי ליצור כלי שיט חדש לגמרי לסריקה. אם לא נוסף כלי שיט חדש, צור סריקה חדשה באמצעות אחת מהאפשרויות המתוארות להלן.
   1. בחר העתק נוכחי כדי ל....

תוצאות

אלגוריתם מדידת צמיחת יתר של נוירוטים מסוגל לזהות נוירונים הן ברשתות עצביות והן בתאי עצב בודדים. הוא יוצר מסיכה צהובה שמפלחת עצמים בעלי ניגודיות גבוהה, כגון גופי תאים, פסולת תאית, תאים מתים, צמחי רקמות וצללים. בנוסף, מסכת מג'נטה מופיעה על נוירוטים בעוביים שונים. ערכי אורך ה.......

Discussion

מדידה מדויקת של האופן שבו תאי עצב גדלים בתנאים בריאים, פצועים וחולים היא פרמטר קריטי במערכי ניסויים רבים בתחום מדעי המוח. בין אם עובדים עם תרביות אורגנוטיפיות של צמחי DRG שלמים או תרבויות מנותקות, מדידה נכונה של צמיחה אקסונלית הייתה אתגר משמעותי במהלך 20 השנים האחרונות. לל?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660