טכניקה אופטימלית ופשוטה לייצור ותרבות של פרוסות כבד בחיתוך מדויק

Summary

פרוטוקול לייצור ותרבית של פרוסות כבד בחיתוך מדויק (PCLS) לחקר כבדי עכברים. המאמר מתמקד בהיבטים מרכזיים של הפרוטוקול, הדורש רק ציוד מעבדה סטנדרטי עם גישה לוויברטום ומאפשר הישרדות של PCLS למשך 4 ימים לפחות.

Abstract

פרוטוקול זה מציג מערכת פשוטה ליצירה ותרבית של פרוסות כבד בחיתוך מדויק (PCLS). PCLS מכיל את כל התאים בסביבה שלמה, ולכן דומה למודל קטן של האיבר כולו. הם מאפשרים לחקור רקמות חיות תוך שכפול הפנוטיפים המורכבים שלהן. פרוטוקול זה מאפשר הכנת פרוסות מכבדי עכברים באמצעות ויברטום וציוד מעבדה סטנדרטי. פרוטוקולים לייצור וטיפוח PCLS חסרים סטנדרטיזציה ויכולים להשתנות באופן דרסטי למדי בהתאם לרקמה המעניינת, סוג הוויברטום בו נעשה שימוש והצורך בחמצן. אלה יכולים להיות קשים לשכפול במעבדות מסוימות שיש להן גישה רק לוויברטום בסיסי ולמתקני תרבית רקמות נפוצים. גיבשנו פרוטוקול המתמקד בחשיבותם של כמה צעדים מרכזיים במסגרת הפרוטוקולים המגוונים שכבר קיימים. פרוטוקול זה, אם כן, מדגיש את החשיבות של שיטת ההטמעה, כיוון החיתוך, מערכת דינמית לעומת סטטית והרלוונטיות של נפח מינימלי של תרבות. ניתן להקים ולשכפל פרוטוקול זה בצורה פשוטה ברוב המעבדות שיש להן גישה לפורס רקמות בסיסי. ביחד ובהתאם לפרוטוקול זה, PCLS יכול להישאר בחיים לפחות 4 ימים. PCLS הוא מודל פשוט, חסכוני וניתן לשחזור לחקר בדיקות פתופיזיולוגיות וטיפוליות לאיברים כמו הכבד.

Introduction

פרוסות רקמה בחיתוך מדויק (PCTS) הן חלקים דקים של איברים. הם מאפשרים לשמר את הארכיטקטורה של האיבר המשכפל מיני איבר תוך שמירה על ההיבט התלת מימדי של תאים שכנים ומטריצה חוץ-תאית. זהו מודל מושך בשל הגישה הקלה שלו, החיסכון בעלויות והמאפיינים הפחות עתירי עבודה תוך שמירה על ארכיטקטורת הרקמות.

PCTS ממלאים פער בין מחקרי תאים במבחנה למחקר בבעלי חיים in vivo, ומתגברים על רוב החסרונות של שני המודלים. PCTS נוצר מאיברים שונים, כגון כבד¹, מעיים ^2,3, מעי^{גס 2}, מוח ^4,5, ריאות ^6,7,8, כליות ^9,10, טחול^11,12, לב^13,14 אך גם גידולים^15,16. הם יכולים גם להגיע מבעלי חיים שונים, כגון עכבר¹, חולדה^17,18 אך גם חזיר¹⁹ ופסולת כירורגית אנושית 15,20,21. למרות ש-PCTS דורש שימוש בבעלי חיים, מה שמרמז על סוגיות אתיות, האיבר מבעל חיים אחד יכול לייצר PCTS מרובים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים בהסכמה עם הנחיות NC3Rs (הפחתה, החלפה, עידון)²² תוך הגבלת וריאציות בין-אישיות.

הפיתוח של פורסות רקמות משופרות, למשל, ויברטומות²³, איפשר מעבר מפרוסות חתוכות ידנית המאופיינות בעובי הטרוגני ושיעור הישרדות נמוך לפרוסות דקות יותר הניתנות לשחזור עם שלמות מבנית שנשמרה טוב יותר.

עם זאת, פרוטוקולים עבור PCTS, וליתר דיוק, הכנה ותרבית של פרוסות כבד בחיתוך מדויק (PCLS) משתנים באופן משמעותי בספרות וחסרים סטנדרטיזציה, במיוחד עבור פרמטרים חיוניים כגון ציוד חיתוך, תוכן בינוני ותנאי תרבית. הפרוטוקולים יכולים גם להשתנות באופן ניכר בהתאם לרקמת המקור. חלק מהפרוטוקולים ידרשו חמצון של המאגר או התרבית עם כמה מערכות ביו-ריאקטור מסובכות²⁴. הם בדרך כלל מתמקדים בנפרד בהיבטים טכניים שונים או מיועדים לרקמות שונות ולעתים קרובות יכולים להיות יקרים ומאתגרים יותר לשכפול במעבדה הממוצעת בצורה חסכונית.

כאן, פרוטוקול זה מאגד כמה נקודות מפתח כגון שיטת ההטמעה, כיוון החיתוך, השימוש בשקעים²⁵, מערכת תרבית דינמית²⁶ והחשיבות של נפח מינימלי של תרבות. חלק מהשלבים הללו עברו אופטימיזציה בעבר באופן עצמאי או בהקשר אחר, כגון פיברוזיס²⁷ או תגובת גידול²⁸. פרוטוקול זה מדגיש גם את החשיבות של הטמעה באמצעות סוגים מסוימים של פורסים וכיוון החיתוך, שהם שניהם פרמטרים קשים לשליטה ולעתים קרובות מוזנחים בספרות. שיטה פשוטה זו מייצרת PCLS הנשמר בתרבית למשך 4 ימים לפחות עם התקנה קלה ושימוש בציוד מעבדה סטנדרטי עם גישה לפורס רקמות בסיסי.

Protocol

עכברי CD57Bl/6J מסוג פרא נרכשו ממעבדות צ'ארלס ריבר. לעכברים הייתה גישה חופשית למזון ומים, שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד עם תנאי טמפרטורה ולחות מבוקרים ועם מחזור אור של 12 שעות. בעלי חיים בני 3 שבועות הוקרבו, וכבדים נקטפו מיד ללא זלוף. כל העבודות בבעלי חיים אושרו לאחר ביקורת אתית מקומית על ידי מועצת הביקורת האתית והרווחה של בעלי החיים של אוניברסיטת קולג' לונדון ובוצעו תחת רישיון פרויקט של משרד הפנים PP9223137 ובהתאם לחוק הנהלים המדעיים של משרד הפנים (בעלי חיים) (1986) והנחיות ARRIVE. כל המאמצים נעשו כדי להגביל את הפגיעה בבעלי חיים בהתאם לנוהג המקובל ביחידה לשירותים ביולוגיים ביוניברסיטי קולג' לונדון.

1. התכוננו לניסוי

1. ביום שלפני הקטיף, בצע את השלבים הבאים.
   1. הכן 1 ליטר של מאגר קרבס-הנסלייט (KREBS) על ידי המסת בקבוקון אחד של אבקת קרבס ל-1 ליטר מים סטריליים. מצננים אותו ל-4 מעלות צלזיוס ושומרים אותו על קרח רטוב.
   2. מחטאים את המגש עם 70% אתנול ושוטפים עם PBS סטרילי. שמור את המגש עטוף בנייר כסף במקרר למשך הלילה כדי לסייע בשמירה על סביבה קרה בזמן החיתוך.
   3. יש לרסס את כל שאר החלקים הניתנים להסרה באתנול, לשטוף עם PBS סטרילי, להשאיר לייבוש ולשמור אותם סטריליים. חיטוי הלהבים ושמור אותם סטריליים עד לשימוש.
   4. הכן 4% w/v אגרוז נמס נמוך במים סטריליים. לאחר ההשעיה וההמסה, יש לאחסן את האגרוז במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.
2. ביום הקציר ולפני קציר הכבד, בצע את הצעדים הבאים.
   1. ממיסים את האגרוז הנמס הנמוך של 4% ושומרים אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש לוודא שהאגרוז התקרר ל-37 מעלות צלזיוס ושכל הבועות התפזרו לפני השימוש.
   2. הכן את צלחות התרבות על ידי הוספת 2.6 מ"ל, 1.5 מ"ל ו -0.7 מ"ל לבאר בהתאמה לצלחות 6, 12 ו -24 באר. הוסיפו 8 מיקרומטר תוספות נקבוביות לכל באר. הנח את הצלחות באינקובטור לח המוגדר לרמת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-21% O₂ . זה יעזור להתאים את ה-pH תוך חימום המדיה, כך שהיא מוכנה לתרבית.
   3. תרבית את הפרוסות עם תוספות נקבוביות של 8 מיקרומטר כדי לאפשר גישה לשני הפנים של הפרוסה. הכן את המדיה באופן הבא: הוסף ל-William's Medium E (WME), תוסף L-גלוטמין 2 מ"מ, סרום בקר עוברי 10% (FBS), 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, תמיסת D-גלוקוז 25 מ"מ ותמיסת HEPES 15 מ"מ.

2. איסוף כבד והכנה (15 דקות)

1. עקר את כל המכשירים לפני הקציר.
2. להרדים את העכבר על פי נהלים מקומיים לטיפול בבעלי חיים למטרות מדעיות באמצעות מסכת איזופלורן. לפני פתיחת חלל הבטן, צבט בין אצבעות הרגליים כדי לוודא שהחיה מורדמת כראוי. אם ניתן להסיר את הכבד במהירות, ניתן להמית את העכבר על ידי חנק_CO2 או פריקת צוואר הרחם. מכיוון שההליך הוא הליך סופני, אל תשתמש במשחת עיניים מכיוון שהדבר לא ישפיע על בעל החיים.
3. יש לרסס את הבטן באתנול 70%. אופציונלי: לגלח את העכבר כדי למנוע זיהום בשיער.
4. פתח את חלל הבטן בעזרת מלקחיים סטריליים ומספריים על ידי חיתוך העור והצפק מאמצע הבטן. נתח את הכבד בעדינות מאיברים או כלי דם אחרים והימנע מפגיעה באונות.
5. יש לאחסן את כל הכבד מיד ב-Krebs Buffer קר כקרח. בצע את כל השלבים הנוספים על הקרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והמשך להכנת הכבד במהירות האפשרית כדי למנוע מוות נוסף של תאים.

3. הטמעת אונות הכבד (25 דקות לכל אונת כבד)

1. מעבירים את הכבד לצלחת פטרי על קרח המכילה בופר קרבס קר כקרח, ומוודאים שהכבד כולו שקוע במלואו.
2. הפרד כל אונה בנפרד באמצעות מלקחיים קהים וסכין חדה וסטרילית כדי למנוע נזק לאונות.
3. בחר את האונה הראשונה לחיתוך ושמור את האונות הנותרות במאגר קרבס קר כקרח עד שהן מוכנות להטמעה וחיתוך.
4. חותכים את כל הקצוות כדי לקבל אונה קלה יותר לניהול עם קצוות ישרים מוכנים להטמעה. זה גם יעזור להסיר חלק מהקפסולה הסיבית של גליסון כדי להקל עוד יותר על החתך. עשו זאת תוך שמירה על משטחי הכבד רטובים במאגר קרבס קר כקרח.
5. מניחים צלחת פטרי בגודל 3 ס"מ (או דומה) על קרח רטוב ויוצקים לתוכה את האגרוז הנמס 4% (כבר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס). שמור היטב על הקרח כדי לאפשר לאגרוז להתקרר בכיוון כלפי מעלה תוך מניעת שקיעת האונה לתחתית והטמעתה בצורה אחידה.
6. השאירו את האגרוז להתקרר עוד יותר למשך 30 שניות והניחו לתוכה את האונה הקצוצה. האונה תתייצב באמצע גוש האגרוז. תהליך ההטמעה דורש תרגול ואופטימיזציה כדי להתאים לכל תנאי מעבדה וניסיון אישי.
7. מניחים את האונה המוטבעת, עדיין על קרח, במקרר למשך 5 דקות. לאחר מכן יש להגדיר את האגרוז בבירור.
8. חותכים את החלק החיצוני של גוש האגרוז. עקור את גוש האגרוז מהצלחת.
9. חותכים את האגרוז לגודל הניתן לניהול יותר, ומוודאים שהצד העליון והצד המודבק לפלטפורמת הוויברטום מקבילים לקצה העליון של האונה.
10. התחל את תהליך החיתוך במהירות האפשרית אך ודא שגוש האגרוז נשמר במאגר קרבס קר כקרח ועל קרח.

4. ייצור פרוסות כבד (40 דקות לאונה)

1. הגדר את הוויברטום לחיתוך בעובי של 250 מיקרומטר, במהירות של 5 ובתדר של 7 הרץ. אלה פרמטרים מנחים; בהתאם לסוג הוויברטום בו נעשה שימוש, זה עשוי לדרוש אופטימיזציה.
2. רססו את אזורי הוויברטום והספסל ב-70% אתנול לפני החיתוך כדי לשמור על הסביבה סטרילית ככל האפשר.
3. מניחים את המגש על הוויברטום ויוצקים קרח סביבו. הנח את הלהבים על הוויברטום בזווית של 10° כלפי מטה ומתחת לאופק.
4. מלאו את מיכל הוויברטום במאגר קרבס קר כקרח. הניחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על הרציף.
5. יבש את קצה גוש האגרוז שיודבק על הרציף באמצעות רקמה סופגת סטרילית.
6. הנח את בלוק האגרוז על הפלטפורמה הנשלפת. מקם את האונה זקופה כדי לאפשר לחתוך אותה לרוחב. למרות שגודל הפרוסות מצטמצם, הדבר מקל באופן דרסטי על תהליך החיתוך על ידי הגבלת הלחץ על האונה בזמן החיתוך.
7. המתן דקה אחת עד שהדבק יתייצב ויטבול את הפלטפורמה הנשלפת לתוך המיכל וודא שבלוק האגרוז מכוסה לחלוטין במאגר קרבס.
8. תכנת את הוויברטום לחיתוך על ידי הגדרת מצבי ההתחלה והעצירה. התחל לחתוך פרוסות עבות יותר בתחילה עד שמגיעים לאונה הכבד.
9. השלך את הפרוסה הראשונה, מכיוון שייתכן שהיא לא נחתכת לעובי הנכון. כדי להימנע מפגיעה בפרוסות, השתמש במרית כדי לאסוף את פרוסות הכבד במקום מלקחיים או מברשות.
   הערה: ניתן להשתמש במברשת קטנה מחוטאת ב-70% אתנול ושטופה ב-PBS סטרילי כדי להנחות בעדינות את הרקמה במהלך תהליך החיתוך.
10. חזור על התהליך עד להגעה למספר הפרוסות הנדרש. האונה עלולה לעקור את עצמה מדי פעם מהאגרוז, ולמנוע שימוש נוסף. אוספים את הפרוסות למאגר קרבס קר כקרח עד לתרבות.

5. דגירה של פרוסות כבד

1. מעבירים את הפרוסות, בעזרת מרית, לבארות המוכנות המכילות את המדיה והתוספות.
2. הנח את הלוחות על שייקר מסלולי, הגדר את המהירות ל-130 סל"ד ודגר באמצעות חממת תרבית תאים קונבנציונלית עם 5% CO2 ו-21% O2 ב-37 מעלות צלזיוס. נפח התרבות הסופי הוא 2.6 מ"ל, 1.5 מ"ל ו -0.7 מ"ל לבאר בצלחות של 6, 12 ו -24 בארות, בהתאמה.
3. הניחו צלחת ריקה אחת מתחת לצלחת התרבות המכילה את הפרוסות בתרבית כדי לאפשר פיזור חום מוגזם שמקורו בפלטפורמת השייקר. החלף את המדיום כל 48 שעות.

6. בדיקת הישרדות תאים

1. העבירו את הפרוסות לצלחת של 48 בארות המכילה 400 מיקרוליטר של מדיה Medium E מלאה של וויליאמס שחוממה מראש והוסיפו 80 מיקרוליטר של MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) מגיב טטרזוליום.
2. לאחר הדגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ על שייקר, העבירו 200 מיקרוליטר של מדיה לצלחת של 96 בארות, ומדדו את הספיגה ב-490 ננומטר באמצעות קורא צלחות מרובות בארות. השתמש בפרוסות שנותרו על הספסל ב-PBS ובטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כבקרות שליליות.

7. צביעה היסטולוגית

1. הפזר והתייבש מחדש את החלקים באמצעות קסילן ואתנול, ואחריהם מים נטולי יונים. מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 3 דקות.
2. שוטפים במים נטולי יונים למשך 5 דקות. טבלו במהירות פי 10 באתנול חומצי (1 מ"ל HCL מרוכז ו-400 מ"ל אתנול 70%).
3. יש לשטוף פעמיים במים נטולי יונים ולנגב עודפי מים. טובלים את החלקים באוזין למשך 30 שניות.
4. יש לייבש ל-95% אתנול, ולאחר מכן ל-100% אתנול למשך 5 דקות, פי 3 כל אחד. טובלים חלקים בקסילן 3x למשך 15 דקות כל אחד. הנח כיסויים על מגלשות.

תוצאות

בעת הקציר, הזלוף של החיה מושמט בכוונה כדי להבטיח עיבוד מהיר של האיבר ולמנוע נזק לאיברים. הכבד נשאב במהירות לאחר החתך ומונח מיד במאגר מגן איברים קר כקרח, למשל, בופר קרבס^24,29. למרות שחיתוך רקמת כבד טרייה ללא הטבעה תואר בעבר¹, הטמעת ...

Discussion

אנו מדגימים כי ניתן להשיג בקלות ייצור וטיפוח PCLS תוך הבטחת זמן מחצית חיים של 4 ימים לפחות. פרוטוקול זה מסכם חמישה שלבים קריטיים: שיטת ההטמעה אם נעשה שימוש בסוג זה של ויברטום, כיוון החיתוך, מערכת דינמית של תרבית, נפח מינימלי של תרבית ושימוש בתוספות.

פרוטוקולים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 cm petri dish	Any		any suitable for cell culture
6, 12, 24 well culture plate	Any		any suitable for cell culture
Cyanoacrylate super glue	Any
D-Glucose	Gibco	A24940
Eosin	Merck	HT110316
Ethanol	Any
Fetal Bovine serum	ThermoFisher	26400044
Gentamycin	Gibco	15750060
Hematoxylin	Merck	51275
HEPES	Gibco	H0887
inserts 8um, for 12 well plates	Strastedt	83.3931.800
inserts 8um, for 24 well plates	Strastedt	83.3932.800
inserts 8um, for 6 well plates	Strastedt	83.3930.800
KREBS	Merck	K3753
Laminar Flow Hood			Hepa air filtration
Low melting agarose	ThermoFisher	16520050
MTS tetrazolium reagent	Abcam	ab197010
multi-well plate reader	Any
PBS tablets	ThermoFisher	P4417
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Scalpel blade	Any
Surgical forceps	Any		with a flat square-tip
Surgical scissors	Any
Vibratome	Leica	VT1000 S
William’s Medium E with GlutaMAX (WME)	ThermoFisher	W4125