שיטה מהירה לכליאה וטיפול בטוח בדבורים בשטח

Summary

אנו מדגימים שיטה בדוקה לטיפול בטוח בדבורים שנאספו בשדה. שיטה זו מאפשרת מניפולציה מהירה, זיהוי, דגימה גנטית ואישור של אינטראקציות צמח-חרקים באמצעות אבקה שנאספה בזמן הדגימה. גישה זו, הניתנת להתאמה בקלות, מציעה אמצעי חסכוני ולא קטלני לחקר קבוצות חרקים נדירות.

Abstract

שיפור ההבנה של הביולוגיה והאקולוגיה הבסיסית של מאביקי חרקים רבים, במיוחד טקסונים מומחים או נדירים, הוא בראש סדר העדיפויות של חוקרים רבים. ככזה, לעתים קרובות יש צורך להגביל באופן זמני אורגניזמים שנאספו בשדה באופן שאינו מזיק על מנת להשיג מידע או לתמוך במחקרים נוספים. פרוטוקול זה מייצג שיטת שדה שנבדקה ביסודיות, מהירה וזולה לטיפול בטוח בדבורים בעלות חשש לשימור שניתן להתאים בקלות לצרכי פרויקט ספציפיים, כולל זיהוי אורגניזמים, הסרת אבקה, סימון ו/או איסוף דגימות רקמה לא קטלניות לניתוח גנטי. מתודולוגיה זו יכולה לשמש כאופציה נוספת בארגז הכלים של החוקר לשימוש כאשר מתעוררים תרחישים מסוימים. צפוי כי ניתן להתאים מתודולוגיה זו לשימוש עם מיני חרקים אחרים וכן להשתמש בה על ידי אנשים בעלי ניסיון ומיומנות שונים. זה יכול להיות בעל ערך רב לחוקרים החוקרים דבורים מתמחות או עורכים מחקרים ספציפיים למארח. איסוף הנתונים שיתאפשר על ידי פרוטוקול זה יהיה בעל ערך רב כדי לסייע לחוקרים להתמודד עם פערי נתונים קריטיים עבור מינים רבים של מאביקים, מבני רשת מאביקים של צמחים ויוזמות שימור וניהול מאביקים.

Introduction

גוף הולך וגדל של ראיות תומך בירידה באוכלוסיית דבורי הבר ומאביקים אחרים ובשינויים נלווים בקהילת המאביקים 1,2,3,4. אובדן מתמשך מאיים על עצם השירות של האבקת חרקים החיונית לשמירה על המגוון הביולוגי, תפקוד המערכת האקולוגית והייצור החקלאי⁵. יתר על כן, עבור דבורי בר רבות, במיוחד מינים נדירים, קיימים פערי ידע משמעותיים שיכולים לעכב פעולות ניהול ושימור נאותות ^6,7.

כדי לסייע בטיפול בחסרים אלה בנתונים, חוקרים פיתחו מגוון שיטות לחקר מאביקי חרקים, שימוש בבתי גידול קשורים והעדפות הפרחים שלהם. בעוד שבדרך כלל נעשה שימוש במלכודות פאן, מלכודות שבשבת כחולה, מלכודות חולשה, מלכודות הופעה ואיסוף ישיר על ידי רשת ידנית, לרבות מהשיטות הללו יש חסרונות משמעותיים 8,9,10,11. שיטות נפוצות לזיהוי המאביקים עלולות לגרום לתמותה של אורגניזמים, ללא קשר לשאלה אם יש לזהות את הדגימה במעבדה (למשל, באמצעות מיקרוסקופ). תמותה יכולה להיות מוצדקת והכרחית עבור מחקרי חרקים רבים. עם זאת, כאשר עובדים עם חרקים בסכנת הכחדה, נדירים או לא נחקרים שסטטוס האוכלוסייה שלהם מוגבל או לא ודאי, החוקרים חייבים להפחית את התמותה, הפציעה או הלחץ של אורגניזמים כדי להפחית את הסבירות להשפעה שלילית על אוכלוסיות החרקים הללו. לכן, כאשר עובדים עם מינים בסיכון או מינים שניתן לזהות בקלות על ידי המאפיינים המבחינים העיקריים שלהם, יש לנקוט בגישות דגימה פחות הרסניות במידת האפשר.

שיטות לא קטלניות שהוצעו לאיסוף חומר גנטי מדבורים כוללות איסוף צואה, אקסוביה¹² וקצות כנפיים¹³. עם זאת, שימוש בשיטות אלה על דבורים שנאספו בשדה עשוי להיות בלתי נסבל בשל הזמן הנדרש ו/או ההשפעה הפוטנציאלית על הכנפיים, ולהשפיע לרעה על התעופה והתנהגויות אחרות. הוכח כי הסרה חלקית של אנטנות אינה פוגעת בהישרדות של דבורי אוגלוסינה שנדגמו¹⁴. כמו כן, דגימה של החלק הסופי של הטרסוס של הרגל האמצעית לא הפחיתה באופן משמעותי את הישרדות עובדי Bombus terrestris ¹⁵. שיטת דגימה לא קטלנית נוספת כוללת איסוף שאריות חלבון על ידי טבילה זמנית של דבורים בתמיסת חיץ ולאחר מכן שחרורן¹⁶. ניתוח ההישרדות הראה כי לא היו הבדלים משמעותיים בין דבורים שטופות חוצץ לדבורים לא שטופות. ישנן מגבלות לכל טכניקה, שיש לקחת בחשבון בעת התייחסות לשאלות מחקר ספציפיות ומטרות הפרויקט הכוללות.

זיהוי טקסונומי מדויק של אורגניזמים הוא קריטי למחקר יעיל. עם זאת, עבור טקסונים רבים של מאביקי חרקים, זה תלוי מאוד במין המעניין וברמת הידע והניסיון של החוקר או הצופה. בעוד שניתן לזהות מיני דבורים רבים בשטח, ראיות התומכות בתצפית יכולות להיות קריטיות. בעוד שרוב מחקרי המאביקים בדרך כלל אוספים ושומרים פרטים כראיות, השימוש בתמונות וסרטונים, כמו גם צילום וידאו תלת מימדי באמצעות מציאות מדומה יכול לשמש כפרוקסי להבחנה בין מינים מסוימים מבלי להקריב את הפרטים שנצפו¹⁷. הבחנה בין מינים מסוימים עשויה לדרוש תשומת לב מיוחדת וצילומים של מאפיינים מורפולוגיים ספציפיים; במצבים אלה, האורגניזמים חייבים להיות מסוגלים להיות ניתנים למניפולציה ולהגביל אותם למיקום ייחודי כך שניתן יהיה לצלם את הדמויות המורכבות המבחינות בצורה מהימנה.

הגבלה זמנית של דבורים לזיהוי יכולה להיעשות בכמה דרכים, כולל קירור הדגימה ו/או שימוש בפחמן דו חמצני כדי להאט את הדבורים^18,19. עם זאת, שיטות אלו עשויות לשנות התנהגות, וכתוצאה מכך דבורים מטופלות איטיות יותר להחזיר את פעילותן, ובכך להשפיע על חיפוש מזון, כושר אורגניזם, או להגביר את הסיכון לטריפה 20,21,22. בנוסף, טכניקות כאלה מגדילות בסופו של דבר את הזמן שבו אורגניזמים מוגבלים ומטופלים. זה, בתורו, מגביר את הלחץ של האורגניזם ואת זמן העיבוד בשטח. לכן מתודולוגיות בטוחות ויעילות יותר יהיו רצויות מאוד.

מספר מחקרים השתמשו באבקה שנאספה מדבורים או ממקורות אחרים כדי להבין טוב יותר את העדפות המזון, לבנות רשתות אינטראקציה בין צמחים למאביקים, לזהות זיהום סביבתי (למשל, שאריות חומרי הדברה) ולהעריך אקולוגיה תזונתית 23,24,25,26,27,28,29 . דבורים רבות מטפחות את עצמן כאשר הן כלואות במיכל. לכן, נעשה שימוש בשיטות לא קטלניות של דגימת אבקה³⁰ (למשל, צינורות מיקרו-צנטריפוגה). עם זאת, במקרים בהם טיפוח עצמי אינו מתרחש, שימוש במיכל מישוש יותר, כגון שקיות הניילון הניתנות לסגירה חוזרת המשמשות בפרוטוקול זה, מאפשר להפעיל לחץ עדין על חלקי גוף ספציפיים כך שהאבקה תבוא במגע עם שקית הניילון, מה שמוביל לסבירות גבוהה יותר לקבל דגימת אבקה מאשר שימוש במיכלים קשים מסורתיים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שנבדק היטב על שלושה מיני דבורים בסיכון. בעוד שהוא אינטנסיבי, הוא מאפשר איסוף נתונים מקיף ממאביקי חרקים תוך מזעור איום התמותה על האורגניזמים הבודדים. המטרה הכוללת של שימוש במתודולוגיה זו היא לספק אמצעי בטוח ויעיל ללכידה, זיהוי ושחרור בטוח של חרקים. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא שהוא מתגבר על רבות מהמגבלות של איסוף חרקים מסורתי. הוא מספק דרך קלה לסמן פרטים, לאסוף חומר גנטי לא קטלני ולאסוף דגימות אבקה, כל זאת תוך מזעור זמן הטיפול והלחץ על האורגניזם. בעוד שלשיטות איסוף חרקים מסורתיות יש יתרונות רבים³¹, כדי לעזור להתגבר על חלק מהמגבלות שלהן, הקמנו חלופה כך שניתן יהיה להגביל חרקים לזיהוי לפני שחרור מהיר ובטוח. בהתאם למטרות הפרויקט, ניתן לנקוט בצעדים נוספים בזמן שהדבורה מוגבלת לאיסוף נתונים חשובים אחרים.

Protocol

1. הכנת איסוף שדה

1. אשר את מטרות הפרויקט (למשל, זיהוי אורגניזם, דגימת רקמות גנטיות וכו').
2. סקור את טבלת החומרים ואסוף את כל הפריטים הרלוונטיים הספציפיים למטרות הפרויקט.
3. ודא שכל הציוד הדיגיטלי (למשל, סמארטפון, מצלמה, מערכת מיקום גלובלית כף יד [GPS]) טעון במלואו ושסוללות רזרביות נטענות וארוזות.

2. לכידת ואבטחת אורגניזם

1. רשמו את הפרמטרים המעניינים של האתר עם ההגעה לשדה, כולל תאריך, שעת התחלה, אתר/מיקום שדה, וכל מידע רלוונטי אחר (למשל, תנאי מזג אוויר, צמחים דומיננטיים בכיסוי קרקע, צמחים פורחים וכו') שעשוי להידרש (איור 1).
2. לכוד דבורה בודדת מעניינת באמצעות טכניקת הרשת המתאימה. השתמש ברשת ידנית באמצעות רשת חרקים אווירית או רשת טאטא המבוססת על המין המרכזי.
   הערה: טכניקות לכידה אחרות, כגון איסוף באמצעות בקבוקון/צינור צנטריפוגה, יכולות לשמש גם ללכידת חרקים.
3. התבונן חזותית בדגימה דרך שקית הרשת כדי לקבוע אם היא דומה לטקסון המעניין. אם לא, שחרר את הדגימה בבטחה והמשך במדידה.
4. אם נראה שהדגימה היא המין המרכזי, אבטח את הדגימה בתוך שקית הרשת כך שהיא לא תוכל לברוח (למשל, על ידי חפיפה של החלק העליון של שקית הרשת מעל המסגרת, פיתול/הגבלת צוואר שקית הרשת, או סגירת יציאות פוטנציאליות בדרך אחרת).
5. אסוף את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת ופתח את שקית הדגימה.
6. ודא שהדבורה המעניינת נמצאת ליד קצה שקית הרשת.
7. ביד אחת, אחוז בשקית הרשת מיד מתחת לדגימה. החזק את שקית הרשת כך שהקצה (שבו החרק מוגבל) מכוון כלפי מעלה ופתח הרשת (כלומר, החישוק) תלוי למטה.
   הערה: רוב החרקים הם פוטוטרופיים, וכאשר הם מוגבלים, בדרך כלל עפים/זוחלים לעבר האור.
8. בעזרת היד השנייה (כלומר, היד שאינה מחזיקה את שקית הרשת), הנח את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת בפתח הרשת ודרך שקית הרשת עד שמגיעים ליד מיד מתחת לדגימה.
9. שחרר בזהירות את אחיזת היד, והגביל את הדגימה מספיק כדי לאפשר ליד המחזיקה את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת לנוע לאזור הסגור עם הדגימה. שימו לב למיקום הדגימה באזור הסגור כדי להפחית את הסבירות להיעקץ, לפגוע בדגימה ולברוח.
10. תפעל את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת כך שתיפתח לרווחה מספיק כדי לאפשר לדגימת החרק להיכנס. עשה זאת על ידי הפעלת לחץ משני צידי החותם או סיבוב השקית עם האגודל והאצבע האמצעית מתחת לאטם.
11. מקם את פתח שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת מעל הדגימה ותמרן בעדינות את החרק לתוך השקית. כפי שהוזכר קודם לכן, מכיוון שרוב החרקים הם פוטוטרופיים, כוון את היד המכילה את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת לכיוון השמש/שמיים, ובכך הקל על תנועת הדגימה לתוך השקית.
12. לאחר שהדגימה בפנים, אטום היטב את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת.
13. הסר את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת המכילה את הדגימה מרשת החרקים.
    הערה: מכיוון שחרקים יכולים להתחמם יתר על המידה במהירות ובקטלניות בשקיות אטומות, הרחק את הדגימה מחשיפה ישירה לשמש, באופן אידיאלי במקום מוצל או במיכל מבודד עד לעיבוד, והגבל את זמן העיבוד.

3. זהה את האורגניזם

1. בדוק מקרוב את הדגימה כדי לאשר שמדובר בטקסון מעניין. אם מדובר במין אחר, שחררו אותו בבטחה והמשיכו לסקור.
   הערה: כדי למנוע נזק לדגימה, לעולם אל תפעיל לחץ ישיר על החרק כשהוא בתוך השקית. ניתן לשתק דגימות על ידי הפעלת לחץ עדין על הפלסטיק או על ידי מתיחת היקף השקית כדי להפוך את השקית למתוחה סביב הדגימה, ובכך להגביל את התנועה.
2. אם אפשר לאמת את זהות המין בקלות ובדייקנות באופן ויזואלי, קחו שובר תמונה (איור 2). רשום כל מידע נחוץ נוסף על הדגימה (למשל, זמן לכידה, מיקום GPS ספציפי, צמח שביקר, סימונים ייחודיים, תצפית גודל או צבע, התנהגות לפני לכידה וכו').
3. אם יש צורך לבדוק מאפיינים פיזיים ספציפיים כדי לאשר זהות, צלמו תמונות מאקרו מפורטות המדגישות את מאפייני המפתח הללו דרך שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת (איור 2).
4. אם לא ניתן להשיג תמונות באיכות מספקת להבחנת תכונות דרך שקית הדגימה, חשוף את חלקי הגוף של הדגימה המעניינים לבדיקה מדוקדקת על ידי חיתוך אחד משני קצות הפינה הלא אטומים של שקית הדגימה (כלומר, הפינות התפורות יחד או שאינן ניתנות לסגירה חוזרת). לדוגמה, חתכו חור קטן כדי לחשוף רק את הראש, הבטן או הרגל (איור 3A-C). לשם כך, תפעל את הדגימה כך שחלק הגוף המעניין ינוע תחילה לכיוון החור החתוך/הפינה.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את הגודל והמיקום של החור שנחתך בשקית ואת כיוון החרק כדי לקבל את התצלום הדרוש.
5. לאחר הזיהוי, דלג לסעיפים הרלוונטיים לשיטות הבאות והרצויות. ראה סעיף 4 לטכניקת הסרת מקטעי אנטנה, סעיף 5 לסימון חרקים ו/או סעיף 6 להשגת דגימות אבקה.

4. השגת דגימות גנטיות לא קטלניות מאנטנות

1. השתמש במספריים כדי לחתוך באלכסון אחת משתי הפינות הלא אטומות (כלומר, הפינות התפורות יחד או שאינן ניתנות לסגירה חוזרת) של שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת. ודא שהחתך שבוצע גדול באופן מינימלי מרוחב ראש הדבורה (איור 4).
2. תפעל את הדגימה כך שהיא תנוע עם הראש לכיוון החור החתוך/הפינתי.
   הערה: ניתן להתאים שלב זה לאיסוף דגימות רקמה אחרות לניתוח גנטי (למשל, רגל שלמה, רגל חלקית). בהתאם לכך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את גודל ומיקום החור שנחתך בשקית ואת כיוון החרק כדי להשיג את הדגימה הדרושה.
3. ברגע שראש הדבורה בולט מהשקית, הפעילו לחץ בעדינות על הפלסטיק שמסביב כדי לגרום לו להיות מתוח סביב החרק, מה שמגביל את התנועה (איור 3A).
4. אם החור גדול מדי, גלגל את השקית על עצמה כדי להגביל עוד יותר את פתח החור ולאבטח את הדגימה. אם אינך בטוח בגודל החור המתאים, בצע את שלבים 4.2 ו-4.3 בתוך רשת חרקים או כלוב טיסה כדי להבטיח שהדגימה לא תברח במלואה. השתמש בשקית נוספת אם החתך הפינתי המקורי גדול מדי.
5. מקם את השקית כך שראש החרק יהיה ישירות מעל מיכל האיסוף (למשל, צינור מיקרוצנטריפוגה/בקבוקון המכיל תמיסת חיץ/אתנול) ושהמיכל עבור הדגימה הגנטית מסומן כראוי עם מזהה הדגימה הייחודי המתאים לכל נתוני הדגימה האחרים (איור 3D).
6. בעזרת מספריים נקיים ומעוקרים, חותכים חלק מקטע אנטנה אחד. בדוק ויזואלית את המיכל כדי לאשר שהדגימה נמצאת בתוך המיכל.
   הערה: בעת חיתוך, כדאי לעבוד על מצע נקי, מעוקר ובהיר (למשל, Kimwipe). זה מבטיח שאם הדגימה לא תיפול למיכל איסוף הדגימות, ניתן לאחזר אותה בקלות עם מלקחיים עם סיכון מינימלי לזיהום.
7. אבטח את מכסה מיכל איסוף דגימות הרקמות וסובב את המיכל כך שהדגימה תלויה בתוך התמיסה (למשל, תמיסת חיץ/אתנול).
8. הנח את מיכל איסוף דגימות הרקמות (עם דגימת האנטנה) במיכל מאובטח, באופן אידיאלי במקום קריר ומוצל המוגן מפני אור שמש ישיר ו/או טמפרטורות קיצוניות, כגון מצנן שדה.
9. שחרר בבטחה את הדגימה ליד נקודת הלכידה המקורית.
   הערה: ניתן גם לסמן דגימה (ראה סעיף 5) לפני השחרור כדי לזהות אותה בקלות כאילו נדגמה אם היא נבדקה/נלקחה מחדש.

5. סימון האורגניזם

1. עם הדגימה בשקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת, חותכים חור קטן באמצע שקית הדגימה.
   הערה: חור זה הוא בנוסף לחור שנוצר בסעיף 4. החור לא צריך להיות גדול יותר מאזור בית החזה של החרק. המיקום של המקום שבו יש לחתוך את החור יכול להשתנות בהתאם לגודל החרק ואזור הסימון הרצוי.
2. הפעלת לחץ עדין על הפלסטיק משני צידי הדגימה, תמרן את החרק כך שבית החזה נמצא ישירות מתחת לחור (כלומר, שהחלק העליון של בית החזה נחשף דרך השקית). המשך בלחץ עדין כדי להבטיח שהדגימה תישאר במקומה (איור 5A).
   הערה: אזורי סימון אחרים עשויים להיות טובים יותר עבור חרקים מסוימים (איור 5B). חלק מהמשתמשים מוצאים שזה מועיל יותר להגדיל את החור הקיים (מקטע 4) ולתפוס את הדבורה על ידי החזקת בית החזה שלה כשהיא מגיחה (איור 5C). גישה זו עלולה להגדיל את הסיכוי להיעקץ. בנוסף, ניתן לשנות את מכשירי הסימון של מלכת דבורי הדבש כדי להגביל ולסמן דבורים אם המשתמש מוצא את זה קל יותר. עם זאת, שיטה זו דורשת העברה למכשיר אחר ועלולה לזהם דגימות אבקה.
3. בעזרת עט סימון צבע (או חומר סימון אחר שנחשב מתאים לטקסון המעניין), סמן את הדגימה בהתאם למתודולוגיה הספציפית לפרויקט שנקבעה מראש.
   הערה: שיטות הסימון ישתנו בהתאם למטרות ועשויות להיות פשוטות, מה שמצביע על כך שהפרט נלכד, או מורכבות, ומאפשרות זיהוי של פרטים (למשל, באמצעות קידוד צבע או דפוס ייחודיים) (איור 5C).
4. החזק את הדגימה במקומה עד שהסימן המיושם יבש מספיק.
5. צלם את האדם המסומן לאישור צבע ומיקום צבע ייחודיים.
   הערה: ניתן לצלם אנשים בקלות ובמהירות ישירות דרך שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת (איור 5D).
6. שחרר בבטחה את הדגימה ליד נקודת הלכידה המקורית.

6. איסוף דגימות אבקה

1. עם הדגימה בשקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת, בדוק אותה בזהירות לאיתור אבקה נראית לעין.
   הערה: מכיוון שסוג האבקה וכמותה משתנים מאוד, לפעמים האבקה אינה נראית על הדגימה בעין בלתי. אם השלבים הקודמים כבר הושלמו, יתכן ששאריות אבקה מהדגימה כבר נמצאות בשקית.
2. אם אבקה נראית על הדגימה, הגבל את תנועת הדגימה על ידי הפעלת לחץ עדין על הפלסטיק משני צידיו.
3. בעזרת אצבע, שפשפו בעדינות או דחפו את הפלסטיק כנגד סטאות או חלק גוף המכיל אבקה כדי להקל על הסרת האבקה.
4. אם האבקה אינה נראית על הדגימה, מקסם את המגע בין הדגימה לפלסטיק כדי לראות אם שאריות אבקה קטנות מוסרות מהמכלול.
5. אשר באופן גלוי שאבקה נמצאת בשקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת, במידת האפשר (איור 4).
6. שחרר בבטחה את הדגימה ליד נקודת הלכידה המקורית.
7. אטום היטב את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת המכילה את דגימת האבקה.
   הערה: אם נחתך חור בשקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת, יש להניח אותו בתוך שקית דגימה אחרת הניתנת לסגירה חוזרת כדי למנוע זיהום או אובדן אבקה.
8. סמן את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת עם מזהה דגימה ייחודי המתאים לחרק הבודד ונתונים אחרים (למשל, מזהה מין חרקים, תאריך, מיקום, שעה, מין, רשומת ביקור פרחים וכו').
9. הנח את שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת עם דגימת האבקה במיכל מאובטח, באופן אידיאלי במקום קריר יותר, כדי להגן עליה מפני אור שמש ישיר ו/או טמפרטורות קיצוניות.
   הערה: במידת הצורך, עקוב אחר פרוטוקולים ספציפיים לפרויקט לשימור אבקה בשטח (למשל, ניתוח גנטי, מורפולוגיה של אבקה).

תוצאות

מתודולוגיה זו שימשה עבור שלושה מיני דבורים בסיכון (Osmia calaminthae, Caupolicana floridana ו-C. electa) בדרום מזרח ארצות הברית. עד כה, מאות דבורים וצרעות נאספו ושוחררו בבטחה. אף דבורה לא מתה בעת השימוש במתודולוגיה זו; אלה שנקבעו כדגימות שוברים ונשמרו כרשומת מיקום חדשה אצל הסוכנות המנהלת המתאימה הוקרבו כראוי לאחר איסוף הנתונים. טבלה 1 מציגה מאפיינים מורפולוגיים שונים שהוערכו כמו גם נתונים אחרים הניתנים לכימות שניתן לאסוף באמצעות פרוטוקול זה 14,32,33,34,35,36.

איור 1: גיליון נתונים לדוגמה המציג נתונים שניתן לאסוף בשטח. הנתונים הספציפיים שנאספו ישתנו בהתאם למטרות הפרויקט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות שישמשו כשוברים. צילום תמונות שישמשו כשוברים של ההתרחשות חיוני למטרות דיווח. תמונות של מאפיינים מזהים מובהקים נחוצות כאשר מינים מרובים חולקים מאפיינים דומים. ניתן להבחין בין Anthidium maculifrons זה שנמצא בפלורידה לבין אחרים בסוג על סמך הצהוב על הנוף והראש שלו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הנחת החור בשקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת. ניתן לשנות את מיקום החור בשקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת כדי לחשוף חלקי גוף ספציפיים מעניינים לצילומים או לדגימות גנטיות. בתמונה המורכבת הזו, ראש הדבורה (A), (B) הבטן והרגל (C) חשופים לתצלום. ברגע שהדבורה מוגבלת ואינה יכולה לזוז, היא נחה לעתים קרובות וניתן למקם אותה כדי לקבל צילום מאקרו. (D) דגימה גנטית יכולה להילקח גם כאשר הדבורה נמצאת בתנוחות האלה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שקית איסוף עם דבורה המציגה פינה אחת חתוכה באלכסון. אם רוצים להתבונן מקרוב בראש הדבורה, החיתוך בפינת השקית ישתנה בגודלו בהתאם לגודל הראש של הדבורה. אבקה ואפילו הפרשות צוף עשויות להימצא בשקית לזיהוי אבקה עתידי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות של שקית דגימה הניתנת לסגירה חוזרת עם דבורים. כדי להימנע מעקיצה בזמן סימון הדבורה, ניתן ליצור חור בשקית, ולמקם את בית החזה (A) מתחת לחור. (B) כתלות בגודל הדבורה, היא יכולה להיות מסומנת גם על הבטן. (C) לחלופין, אפשר גם לשחרר את הדבורה מהחור הפינתי ולדחוס אותה בבית החזה לצורך סימון. טכניקה זו יכולה להגדיל את הסיכוי להיעקץ אך נראה שהיא ממזערת את מריחת העט. ניתן להשתמש בצביעה/מספור ייחודיים כדי להבדיל בין אנשים. (D) דגימות עתידיות שנתפסו מחדש יכולות להיות מצולמות במהירות ובקלות דרך שקית הדגימה הניתנת לסגירה חוזרת ולשחררן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מאפיינים מורפולוגיים שהוערכו באמצעות פרוטוקול זה. ניתן גם לתמרן דגימות כדי לצפות ולתעד תכונות רבות שאינן מיוצגות בטבלה זו (למשל, צורת טרגיט/סטרניט, אורך כולל, משקל, מספר שיניים, אוורור כנפיים, מרחק בין-טגולרי וכו'). אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטת שדה לטיפול ובדיקה בטוחים של דבורים נדירות במטרה הסופית להשיג מידע רצוי על דגימה לא קטלנית או שובר ולשחרר בבטחה פרטים מוקדיים בחזרה לטבע בנקודת הלכידה המקורית. היתרונות של פרוטוקול זה על פני שיטות איסוף אחרות, כגון שימוש בבקבוקונים, הם שניתן להגביל את הדגימה בבטחה כדי לאפשר בחינה מדוקדקת של תכונות מפתח וזיהוי בטוח, מה שמגביל את הנזק הן לחרק והן לחוקר. לעומת זאת, כמו במקרה של מתודולוגיות אחרות^18,19, פרוטוקול זה אינו מחייב הרדמה של הדגימה; ניתן לדגום ולשחרר אותו במהירות עם טיפול מינימלי. שקיות דגימה הניתנות לסגירה חוזרת הן בעלות נמוכה, קלות לרכישה, קלות משקל, ניידות במיוחד וניתנות למחזור, מה שהופך אותן לחלופה מצוינת לצינורות צנטריפוגה. מכיוון שהם חסרים את הנוקשות של חלופות מסוימות (למשל, צינורות בז או מיכלים קשים אחרים), חשוב לנקוט משנה זהירות בעת טיפול בדגימות חרקים חיים. אם יש לקחת דגימה שלמה כשובר, הנחתה במארז יציב תפחית את הנזק הפוטנציאלי לדגימה.

זה מועיל לחוקרים המשתמשים בשיטה זו להיות בעלי ניסיון בטיפול בדבורים ו/או חרקים אחרים מכיוון שהפעלת לחץ רב מדי על הדגימות בזמן שהן בשקית עלולה לגרום לפציעה או לתמותה. כדי לקבל ניסיון רב יותר בטיפול בדבורים, חוקרים מתחילים צריכים לתרגל את הפרוטוקול הזה באמצעות מינים נפוצים יותר (למשל, דבורי דבש). תרגול יעזור למזער את הפציעה או התמותה של החרק. חשוב לציין כי בהתאם לטקסון המוקד, ייתכנו מגבלות למתודולוגיה זו. הגודל הקטן של טקסונים ספציפיים עשוי לדרוש שימוש בציוד צילום מאקרו יקר ומיוחד יותר ו/או שימוש במיקרוסקופי שדה מכיוון שלא ניתן יהיה לבודד את תכונותיהם ולצלם אותם עם החומרים המפורטים בהליך זה, ככל שהמטרה קטנה יותר, כך יכול להיות קשה יותר להשיג תמונות נאותות³⁷. בנוסף, במקרים בהם נדרשים חלקי גוף בלתי נגישים (למשל, לשון, איברי מין וכו'), ייתכן שיהיה צורך בשיטות זיהוי אחרות. איברי מין הם בין תכונות האבחון האינפורמטיביות ביותר עבור חרקים, שיכולים להיות משתנים מאוד בין מינים ויציבים במקצת בתוכם^38,39. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך בשיטות קטלניות, כגון דיסקציה. עם זאת, עבור מינים קשים לזיהוי, ניתן להשתמש בדגימות גנטיות קטנות ולא קטלניות לזיהוי לאחר איסוף שדה⁴⁰, וניתן להשתמש במתודולוגיה המתוארת כאן לאיסוף דגימות כאלה. מודלים סטטיסטיים מפותחים גם כדי לסייע בקישור הדמיה וריצוף DNA לזיהוי חרקים⁴¹.

מגבלה נוספת של המתודולוגיה המוצגת כאן נוגעת לסבירות להיעקץ בעת ביצוע פרוטוקול זה, במיוחד כאשר יש חור שנחתך בשקית. עם זאת, פרוטוקול זה ממזער את הסבירות להיעקץ; המחברים נעקצו רק לעתים רחוקות בשקיות דגימות בזמן שטיפלו בדגימות. כמו כן, יש לציין כי מינים מסוימים של דבורים, חיפושיות וצרעות הצליחו לחתוך את השקיות באמצעות הלסת התחתונה שלהם, ולכן יש לנקוט בזהירות בעת קביעה אם גישה זו תעבוד עבור הטקסונים המעניינים, ובמקרים אלה, יומלץ על שקיות ניילון עבות יותר או מתודולוגיות אחרות. בכל המקרים, על המשתמשים למזער את השימוש בפלסטיק חד פעמי ולמחזר במידת האפשר.

הטקסון המרכזי לפיתוח פרוטוקול זה היה דבורת הקלמינטה הכחולה, Osmia calaminthae (Hymenoptera: Megachilidae), שגודלה כ-10-11 מ"מ בגודל³². מאז שפיתחו שיטה זו, המחברים השתמשו בה על מגוון הימנופטרנים אחרים בגדלים שונים, כולל מיני בומבוס גדולים יותר (Hymnenoptera: Apidae) ומיני Caupolicana , C. electa ו-C. floridana (Hymenoptera: Colletidae). Caupolicana electa יכול לנוע בין 18-23 מ"מ, בעוד ש-C. floridana יכול לנוע בין 16-18 מ"מ³³. כדי לעזור למזער את ההשפעות השליליות על מינים בסיכון, בסכנת הכחדה או רשומים, מומלץ לנסות אותו תחילה על פונדקאיות קרובות ו/או נפוצות כדי לעזור לצבור ניסיון ולבנות מיומנות. השלד החיצוני של דבורים וחרקים אחרים יכול להשתנות, ויש לטפל בזהירות בדגימות פחות חזקות. במצבים שבהם נחקרים גופים קטנים או רכים יותר של חרקים, ייתכן שמתודולוגיה זו לא תספיק. על המשתמשים לקבוע אילו חלקים במתודולוגיה זו יתאימו לטקסון המוקד שלהם.

מעבר למטרה העיקרית של הגבלת אורגניזמים שנאספו בשדה לזיהוי, ניתן לשנות פרוטוקול זה לביצוע משימות שונות הקשורות למחקר שעבורן יש לכלוא את הדבורים בבטחה. לדוגמה, אורגניזמים יכולים להישקל בשדה בזמן שהם בשקיות הדגימה הניתנות לסגירה חוזרת. חוקרים יכולים גם לבצע מדידות שונות של דגימות באמצעות מחוגה בזמן שהחרק מוגבל. לדוגמה, הערכת יכולת הביות של דבורים יכולה להיעשות באמצעות גודל גוף⁴²; המתודולוגיה שלנו יכולה לסייע ברכישת נתונים שיאפשרו הערכה כזו. כמו כן, במקום להשתמש במחוגה, חוקרים יכולים למקם ולצלם סרגל/סרגל קנה מידה ו/או כרטיס צבע ישירות מאחורי הדגימה כדי למדוד תכונות מורפולוגיות מרכזיות בעת עיבוד תמונות מאוחר יותר. יישומים עתידיים של שיטה זו יכולים למנף התקדמות בבינה מלאכותית ולמידת מכונה. ניתן לייעל את הזיהוי, הן בשטח והן במעבדה, באמצעות מכשירים חכמים, ובכך למזער את זמן הטיפול והלחץ על הדגימות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos