A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.
טלומרים, מבני ההגנה בקצות הכרומוזומים, חיוניים לשמירה על אריכות ימים תאית ויציבות הגנום. תפקודם התקין תלוי בתהליכים מוסדרים היטב של שכפול, התארכות ותגובת נזק. קומפלקס המקלטים, במיוחד גורם קושר חוזר לטלומרים 1 (TRF1) ו-TRF2, ממלא תפקיד מרכזי בהגנה על הטלומרים והתגלה כיעד אנטי-סרטני פוטנציאלי לגילוי תרופות. חלבונים אלה נקשרים למוטיב הדנ"א הטלומרי החוזר על עצמו TTAGGG, מה שמקל על היווצרות מבני הגנה וגיוס חלבונים טלומריים אחרים. שיטות מבניות וטכניקות הדמיה מתקדמות סיפקו תובנות לגבי אינטראקציות טלומריות בין חלבון לדנ"א, אך חקירת התהליכים הדינמיים דורשת גישות של מולקולה אחת. כלים כמו פינצטה מגנטית, פינצטה אופטית ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שימשו לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריים, וחשפו פרטים חשובים כגון עיוות DNA תלוי TRF2 וקטליזה של טלומראז. עם זאת, הכנת מבנים של מולקולות בודדות עם מוטיבים טלומריים חוזרים ממשיכה להיות משימה מאתגרת, ועלולה להגביל את רוחב המחקרים המשתמשים בשיטות מכניות של מולקולה אחת. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטה לחקור אינטראקציות באמצעות דנ"א טלומרי אנושי באורך מלא עם פינצטה מגנטית. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבטא ולטהר TRF2, להכין דנ"א טלומרי, להגדיר בדיקות מכניות של מולקולה בודדת ולנתח נתונים. מדריך מפורט זה יועיל לחוקרים בביולוגיה של הטלומרים ובגילוי תרופות ממוקדות טלומרים.
טלומרים הם מבני הגנה בקצות הכרומוזומים 1,2,3. שחיקת הטלומרים במהלך חלוקת התא מובילה להזדקנות התא ולהזדקנותו, בעוד התארכות חריגה של הטלומרים תורמת לסרטן 4,5. כדי שהטלומרים יתפקדו כראוי, תגובות השכפול, ההתארכות והנזק שלהם חייבות להיות מווסתות מאוד 6,7,8. Shelterin, המורכב משש יחידות משנה, ממלא תפקיד מרכזי בהגנה על הטלומרים 9,10,11<....
1. חומרים ושיטות כלליים
איור 1A מדגים את התחומים והמבנים הסכמטיים של TRF1 ו-TRF2, המורכבים מ-439 ו-542 חומצות אמינו בהתאמה, שיכולות להתבטא בתאים פרוקריוטים. הכנת TRF1 תוארה בעבר בספרות41. כאן, אנו מספקים תיאור מקיף ותוצאות מייצגות של הכנת TRF2. איור 1B מראה את מפת ה?.......
פרוטוקול זה משתמש בפינצטה מגנטית למניפולציה של TRFs ברמת המולקולה הבודדת 57,58,59. אנו משתמשים בחרוזים מגנטיים כדי להפריד TRFs ממקטעי DNA גנומיים. לאחר הגבלת העיכול, TRFs נקשרים לחרוזים המגנטיים, מה שמאפשר את הפרדה קלה שלהם מקטעי D.......
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [מענק 32071227 ל- Z.Y.], הקרן העירונית למדעי הטבע של טיאנג'ין של סין (22JCYBJC01070 עד Z.Y.), ומעבדת המפתח הממלכתית של טכנולוגיית מדידה מדויקת ומכשירים (אוניברסיטת טיאנג'ין) [Grant pilab2210 to Z.Y.].
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Digoxigenin | Roche | 11214667001 | |
BfaI | New England Biolab (NEB) | R0568S | |
BSA | Sigma-Aldrich | V900933 | |
CMOS camera | Mikrotron | MC1362 | |
CviAII | New England Biolab (NEB) | R0640S | |
DIG-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-DIGXL | |
DNA extraction solution | G-CLONE | EX0108 | |
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea | Thermo Fisher Scientific | EN0523 | |
dNTP mixture | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme) | P032-02 | |
DTT | Solarbio | D1070 | |
Dynabeads M-270 beads | Thermo Fisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads |
Dynabeads MyOne beads | Thermo Fisher Scientific | 65001 | Streptavidin beads |
Ethanol | Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory | 1083 | |
Glycerol | Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd | SMG66258-1 | |
Imidazole | Solarbio | II0070 | |
IPTG | Solarbio | I8070 | |
Isopropanol | Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory | A1079 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | EN0523 | |
Klenow fragment (3′-5′ exo-) | New England Biolab (NEB) | M0212S | |
LabView | National Instruments | https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html | Graphical programming software |
LiCl | Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm) | BD136449 | |
Lysozyme | Solarbio | L8120-5 | |
MseI | New England Biolab (NEB) | R0525S | |
NaCl | Shanghai Aladdin | C111533 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | Spectrophotometer | |
NdeI | New England Biolab (NEB) | R0111S | |
Ni NTA Beads 6FF | Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd | SA005025 | |
Nitrocellulose membrane | ABclonal | RM02801 | |
PMSF | Solarbio | P8340 | |
Proteinase K | Beyotime Biotech Inc (beyotime) | ST535-500mg | |
rCutSmart Buffer | New England Biolab (NEB) | B6004S | |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R4875 | |
Sodium acetate | SERVA Electrophoresis GmbH | 2124902 | |
Sumo protease | Beyotime Biotech Inc (beyotime) | P2312M |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved