A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.

Abstract

טלומרים, מבני ההגנה בקצות הכרומוזומים, חיוניים לשמירה על אריכות ימים תאית ויציבות הגנום. תפקודם התקין תלוי בתהליכים מוסדרים היטב של שכפול, התארכות ותגובת נזק. קומפלקס המקלטים, במיוחד גורם קושר חוזר לטלומרים 1 (TRF1) ו-TRF2, ממלא תפקיד מרכזי בהגנה על הטלומרים והתגלה כיעד אנטי-סרטני פוטנציאלי לגילוי תרופות. חלבונים אלה נקשרים למוטיב הדנ"א הטלומרי החוזר על עצמו TTAGGG, מה שמקל על היווצרות מבני הגנה וגיוס חלבונים טלומריים אחרים. שיטות מבניות וטכניקות הדמיה מתקדמות סיפקו תובנות לגבי אינטראקציות טלומריות בין חלבון לדנ"א, אך חקירת התהליכים הדינמיים דורשת גישות של מולקולה אחת. כלים כמו פינצטה מגנטית, פינצטה אופטית ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שימשו לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריים, וחשפו פרטים חשובים כגון עיוות DNA תלוי TRF2 וקטליזה של טלומראז. עם זאת, הכנת מבנים של מולקולות בודדות עם מוטיבים טלומריים חוזרים ממשיכה להיות משימה מאתגרת, ועלולה להגביל את רוחב המחקרים המשתמשים בשיטות מכניות של מולקולה אחת. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטה לחקור אינטראקציות באמצעות דנ"א טלומרי אנושי באורך מלא עם פינצטה מגנטית. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבטא ולטהר TRF2, להכין דנ"א טלומרי, להגדיר בדיקות מכניות של מולקולה בודדת ולנתח נתונים. מדריך מפורט זה יועיל לחוקרים בביולוגיה של הטלומרים ובגילוי תרופות ממוקדות טלומרים.

Introduction

טלומרים הם מבני הגנה בקצות הכרומוזומים 1,2,3. שחיקת הטלומרים במהלך חלוקת התא מובילה להזדקנות התא ולהזדקנותו, בעוד התארכות חריגה של הטלומרים תורמת לסרטן 4,5. כדי שהטלומרים יתפקדו כראוי, תגובות השכפול, ההתארכות והנזק שלהם חייבות להיות מווסתות מאוד 6,7,8. Shelterin, המורכב משש יחידות משנה, ממלא תפקיד מרכזי בהגנה על הטלומרים 9,10,11<....

Protocol

1. חומרים ושיטות כלליים

  1. עיין בקובץ טבלת החומרים עבור מלחים, כימיקלים, אנטיביוטיקה, אנזימים, נוגדנים וחומרי שרף המשמשים בפרוטוקול זה.
  2. הכינו מדיום נוזלי Luria-Bertani (LB), צלחות אגר LB, חיץ HEPES, אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד SDS (SDS-PAGE), מלח חוצץ פוספט (PBS), חיץ Tris-EDTA (TE) על פי המתכונים מפרוטוקולי קולד ספרינג הארבור 45,46,47,48,49,50,51,52,53.

תוצאות

איור 1A מדגים את התחומים והמבנים הסכמטיים של TRF1 ו-TRF2, המורכבים מ-439 ו-542 חומצות אמינו בהתאמה, שיכולות להתבטא בתאים פרוקריוטים. הכנת TRF1 תוארה בעבר בספרות41. כאן, אנו מספקים תיאור מקיף ותוצאות מייצגות של הכנת TRF2. איור 1B מראה את מפת ה?.......

Discussion

פרוטוקול זה משתמש בפינצטה מגנטית למניפולציה של TRFs ברמת המולקולה הבודדת 57,58,59. אנו משתמשים בחרוזים מגנטיים כדי להפריד TRFs ממקטעי DNA גנומיים. לאחר הגבלת העיכול, TRFs נקשרים לחרוזים המגנטיים, מה שמאפשר את הפרדה קלה שלהם מקטעי D.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [מענק 32071227 ל- Z.Y.], הקרן העירונית למדעי הטבע של טיאנג'ין של סין (22JCYBJC01070 עד Z.Y.), ומעבדת המפתח הממלכתית של טכנולוגיית מדידה מדויקת ומכשירים (אוניברסיטת טיאנג'ין) [Grant pilab2210 to Z.Y.].

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-DigoxigeninRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS camera MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA extraction solutionG-CLONEEX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
dNTP mixtureNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  beadsThermo Fisher Scientific65305Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beadsThermo Fisher Scientific65001Streptavidin beads
EthanolTianjin No.6 Chemical Reagent Factory1083
GlycerolBeijing Hwrkchemical Co,. LtdSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Chemical Reagent FactoryA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlGraphical programming software 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NanoDropThermo Fisher ScientificSpectrophotometer
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,LtdSA005025
Nitrocellulose membraneABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Sodium acetateSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo proteaseBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

References

  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved