השתלה כירורגית של תאי גידול בחוט השדרה של עכברים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פיתוח של מודל עכברי הניתן לשחזור של גליומה של חוט השדרה על ידי הזרקת תאי גידול לחלל הבין חולייתי, ומציע גישה יעילה יותר ופחות פולשנית למחקר ופיתוח טיפולי.

Abstract

גליומות חוט השדרה הן בדרך כלל גידולים ממאירים של חוט השדרה, מה שמוביל לשיעור גבוה של נכות. עם זאת, הנחיות טיפול אחידות ונתונים מקיפים על גליומות חוט השדרה נותרו מוגבלים בשל היעדר מודלים פרה-קליניים מתאימים לבעלי חיים. פיתוח מודל פשוט וניתן לשחזור של בעלי חיים הפך חיוני לקידום מחקר בסיסי ותרגומי. מודל עכברי הוא אידיאלי, מכיוון שחוט השדרה של העכברים חולק קווי דמיון מבניים עם חוט השדרה האנושי. פרוטוקול זה מתאר יצירת מודל עכברי הניתן לשחזור של גליומה של חוט השדרה על ידי הזרקה ישירה של תאי גידול לחלל הבין חולייתי תוך שימוש בתהליך הקוצני של חוליית צוואר הרחם השביעית כמדריך. בהשוואה לשיטות אחרות, גישה זו יעילה ונוחה יותר, וכוללת חתך קטן יותר, הפחתת פולשניות ואיבוד דם, החלמה מהירה יותר והיווצרות גידול יציבה יותר. מודל זה צפוי לקדם את ההבנה של מנגנוני מחלה, לייעל אסטרטגיות כירורגיות ולתמוך בפיתוח תרופות טיפוליות לגליומות חוט השדרה.

Introduction

גליומות חוט השדרה, כולל אלה של זנב הסוס, הן בדרך כלל ניאופלזמות ממאירות, כאשר 20%-40% מסווגות כאסטרוציטומה והשאר כאפנדימומות¹. בהתבסס על מאפיינים היסטולוגיים, גליומות חוט השדרה מסווגות לארבע דרגות (I-IV). גידולים בדרגה I ו-II נחשבים לגליומות בדרגה נמוכה, בעוד שגידולים בדרגה III ו-IV מסווגים כגליומות בדרגה גבוהה. למרות שגליומות חוט השדרה יכולות להופיע בכל קטע של חוט השדרה, הן נמצאות לרוב באזור צוואר הרחם (33% מהמקרים) והן נדירות יחסית באזורים אחרים, עם 26% מהמקרים באזור בית החזה ו-24% באזור המותני².

ניתוחים, רדיותרפיה וחומרים אלקילטים הם אפשרויות הטיפול העיקריות בגליומות חוט השדרה, בעיקר מניסויים קליניים על גליומות מוח³. עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי למרות שהפרופילים ההיסטולוגיים של גליומות חוט השדרה דומים לאלה של גליומות מוחיות, נוכחותן של חתימות מולקולריות מובהקות מבדילה אותן ממקבילותיהן המוחיות⁴. בקבוצה שלנו, חולי גליומה של חוט השדרה לא הפיקו תועלת משמעותית מכימותרפיה או הקרנות, מה שמדגיש את היעילות המוגבלת של הטיפולים הנוכחיים ואת הצורך באסטרטגיות טיפוליות חדשות⁵. לכן, מודלים אמינים ואינפורמטיביים של בעלי חיים חיוניים לקידום מחקר בסיסי ומחקרים פרה-קליניים.

נכון לעכשיו, קיימים מספר מודלים מבוססים היטב של גליומה של חוט השדרה, כולל השיטה שתוארה על ידי Minru et ^al.6. מודלים אלה משתמשים בעיקר בטכניקות להסרת חוליות בית החזה כדי לחשוף את חוט השדרה ^6,7,8. למרות שמודלים של חולדות שימשו בעבר, הם קשורים לעלויות גבוהות יותר, גדלי מדגם קטנים יותר ואתגרי ניהול גדולים יותר בהשוואה למודלים של עכברים. בנוסף, קיימים יותר מודלים ניסיוניים של עכברים מהונדסים גנטית מאשר מודלים של חולדות. מודל עכבר בעל יכולת חיסונית הוא בעל ערך מיוחד לחקר התגובה החיסונית בתוך המיקרו-סביבה של גידול עמוד השדרה ולפיתוח אסטרטגיות אימונותרפיות לגליומות חוט השדרה. יתר על כן, שיטה זו מתאימה היטב ליצירת מודלים של קסנוגרפט שמקורם בחולה עבור גליומות חוט השדרה.

פרוטוקול זה מציע הליך בטוח, פשוט מבחינה טכנית וניתן לשחזור מהיר ליצירת מודל השתלת גליומה של חוט השדרה בעכברים. המודל צפוי לקדם את המחקר על המנגנונים הלא נחקרים העומדים בבסיס התקדמות הגליומה ולהקל על פיתוח תרופות טיפוליות לגליומות חוט השדרה.

Protocol

פרוטוקול זה נערך בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של טיפול וטיפול בבעלי חיים במחקר ביו-רפואי באוניברסיטת קפיטל מדיקל (AEEI-2021-187). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 נקבות, בני 8 שבועות ובמשקל 19-21 גרם. הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. נקה ועיקר היטב את כל המכשירים הכירורגיים.
2. רססו את שולחן הניתוחים באלכוהול ונגבו אותו בעזרת מגבות נייר סטריליות.

2. הכנת תאי GL261-luc ו-B16-F10-luc להשתלה

הערה: קו התאים GL261-luc GBM הושג באופן מסחרי, בעוד שקו תאי המלנומה B16-F10-luc היה מתנה מפרופסור וואנג שי. שני קווי התאים אושרו כנקיים מזיהום מיקופלזמה באמצעות בדיקות טרום ניסוי.

1. הכינו DMEM מלא (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco) על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין (100 יח'/מ"ל)-סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
2. תרבית תאי GL261-luc או B16-F10-luc במדיום ה-DMEM השלם ואוספת תאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי להשתלה.
3. שטפו את התאים פעמיים עם PBS סטרילי, ואז דגרו אותם עם תמיסת טריפסין-EDTA של 0.05% למשך 3 דקות.
4. העבירו את תרחיף התאים המתקבל לצינור וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, השעו מחדש את התאים ב-PBS סטרילי וצנטריפוגה פעם נוספת.
6. צבעו את התאים בכחול טריפן וספרו תאים ברי קיימא באמצעות מונה תאים.
7. הכן את תרחיף התאים בריכוז של 5 ×^{10 6} תאים/מ"ל עבור תאי GL261-luc או 5 × 10⁵ תאים/מ"ל עבור תאי B16-F10-luc, מה שהופך אותו מוכן לשימוש.

3. הכנת בעלי חיים

1. שקלו והרדימו את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של תמיסת טריברומו-אתנול 2.5% (10 מיקרוליטר / גרם). אשר את ההרדמה על ידי בדיקת אובדן רפלקס הדוושה. ההליך כולו, מההכנה ועד התפירה, אמור להימשך כ-5-10 דקות.
   הערה: מקם את החיה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאורך כל ההליך.
2. חשפו את העור והכינו חלון ניתוח נקי (איור 1A). לגלח את השיער מאזור הצוואר הגבי ואזור של 2 ס"מ המשתרע דו-צדדית מקו האמצע באמצעות קוצץ שיער.
   1. להסרת שיער שנותר, מרחו שכבה דקה של קרם אפילציה על האזורים המגולחים בעזרת צמר גפן והשאירו אותו למשך 1-2 דקות. לאחר מכן, נגב את קרם האפילציה עם גזה לחה בסבון.
3. חיטוי העור באמצעות תמיסת יוד, מיושמת בתנועה סיבובית למשך 30 שניות, ולאחר מכן ניגוב עם 75% אלכוהול להסרת יוד.

4. חשיפת עמוד השדרה הצווארי וקביעת נקודת ההחדרה

1. מקם את העכברים כשהצד הגבי שלהם פונה כלפי מעלה והדק את גפיהם לשולחן הניתוחים באמצעות סרט רפואי. הניחו כרית גזה בעובי 1-2 ס"מ מתחת לאזור הצוואר לתמיכה, ומספקים גישה טובה יותר לחוט השדרה.
2. בצע חתך אורכי של כ-1.5 ס"מ לאורך עור הצוואר באמצעות אזמל ולהב כירורגיים (איור 1B). הפרד בעדינות את שרירי הצוואר על ידי דיסקציה קהה, הקפד להימנע מפגיעה בכלי דם.
3. נתח בזהירות את השרירים הסמוכים לחוליות צוואר הרחם כדי לחשוף את התהליך הקוצני של חוליות צוואר הרחם השביעי, ציון דרך גרמי מובהק בעכברים (איור 1C ואיור 1G-I).
4. נקה כל דם מאזור הניתוח באמצעות צמר גפן סטרילי לפני שתמשיך בהזרקה.
5. הגדר את נקודת הניקוב על 0.5-0.9 מ"מ מקו האמצע של עמוד השדרה, והתאם את עומק ההזרקה ל-0.6-0.9 מ"מ על סמך משקל הגוף של העכברים (16-24 גרם).
   הערה: עומק הזרקת חוט השדרה הוא 0.9 מ"מ לעכברים במשקל 22-24 גרם.

5. הזרקת תאי גידול

1. שטפו היטב מזרק מחט שטוחה של 10 מיקרוליטר בתמיסת PBS סטרילית 2-3 פעמים.
2. משוך 2 מיקרוליטר ממתלה התא לתוך המזרק, וודא שאין בועות אוויר.
3. ייצב את התהליך הקוצני של חוליות צוואר הרחם על ידי אחיזה והרמה בעדינות בעזרת מלקחיים. השתמש במחט משופעת (1.87 מ"מ אורך ו-0.48 מ"מ קוטר) כדי לנקב את הדורה מאטר (איור 1D). לאחר מכן, עברו למזרק מחט שטוח (בקוטר 0.48 מ"מ) כדי להזריק את תאי הגידול (איור 1E).
   הערה: אתר הניקוב נשמר במהלך החלפת המחט, עם מיקום מדויק המאושר על ידי עוויתות הגפיים התחתונות מגירוי עצבי.
4. הזריק את תרחיף התא לאט כדי למנוע הפרעה.
5. שמור את המזרק במקומו למשך 30 שניות לאחר ההזרקה כדי להבטיח השתלת גידול מוצלחת.

6. טיפול לאחר ניתוח

1. סגור את חתך העור על ידי תפירה עם תפר ניילון 3-0 בסוף הניתוח (איור 1F).
2. מקם את העכבר על צדו והנח אותו על מחצלת מחוממת כדי לשמור על חום ולהבטיח נשימה יציבה במהלך ההתאוששות מההרדמה בכלוב.
3. יש לתת בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) פעמיים ביום למשך 3 ימים כדי להקל על הכאב.
4. עקוב אחר העכבר כדי להבטיח שהוא חוזר לפעילות טרום ניתוחית ללא סימני דימום או קריעת פצעים.
   הערה: תפקוד לקוי זמני של חוט השדרה, כולל חולשת הגפיים האחוריות, שכיח לאחר הניתוח ובדרך כלל נפתר תוך 3 שעות. כ-5% מהעכברים עלולים לפתח שיתוק אך בדרך כלל מחלימים תוך 3 ימים. עבור עכברים אלה, ספקו תזונה מלאה מבחינה תזונתית ומי ג'ל ישירות על רצפת הכלוב כדי להבטיח נגישות נאותה. אחוז קטן (כ-5%) מהעכברים שחווים שיתוק עשויים להזדקק להמתת חסד.
5. ודא שלעכברים יש גישה רציפה למים ולמזון.
   הערה: אם בעלי החיים מראים סימנים של ירידה במשקל או שיתוק, יש לשכן אותם בנפרד.

7. הדמיית ביולומינסנציה in vivo

1. יש לתת לעכברים זריקה תוך-צפקית של 150 מ"ג/ק"ג D-לוציפרין המומס ב-D-PBS.
2. הנח את העכברים בתא הרדמה המכיל איזופלורן לזירוז.
3. העבירו את העכברים לסעפת ההרדמה האינטגרלית כדי לשמור על הרדמה במהלך ההליך.
4. בצע הדמיה ביולוגית in vivo כמתואר בדוח הקודם⁹.
   הערה: זמן התגובה האופטימלי ל-D-לוציפרין בהדמיה חיה של בעלי חיים קטנים הוא 10 דקות לאחר ההזרקה. ודא שההדמיה מתבצעת בדיוק 10 דקות לאחר ההזרקה.

תוצאות

כדי לבסס מודל חייתי יציב ואמין של גליומה בעמוד השדרה, החלל הבין חולייתי בין חוליות צוואר הרחם השישית והשביעית בעכברי C57BL/6 זוהה כאתר האידיאלי לחיסון על סמך סקירת ספרות וממצאים ניסויים¹⁰. החוליה הצווארית השביעית מספקת ציון דרך גרמי מובהק, התהליך הקוצני (

Discussion

גליומה של חוט השדרה היא הסוג הנפוץ ביותר של גידול ממאיר ראשוני בחוט השדרה, המהווה למעלה מ-80% מהגידולים התוך-מדולריים. מבחינה פתולוגית, גליומות חוט השדרה מסווגות בעיקר כאפנדימומות או אסטרוציטומות, עם דגש מיוחד על אסטרוציטומה¹¹. בין האסטרוציטומות, חלקן מכילות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A nutritionally complete food and water gelled diet (Nutra-Gel)	Bio-Serv	N/A
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacksonimmuno	115-007-003
B16-F10-luc	Professor Wang Xi's laboratory	N/A
Buprenorphine Related Compound A	Sigma-Aldrich	457071-73-7
CD163 (ABT-CD163) mouse mAb	Immunoway	YM6146
CD86 rabbit pAb	Immunoway	YT7823
Cell counter	Bio-rad	1450102
Cell Counting Slides	Biorad	1450011
DAPI/Sealant Dual Solution (Anti-Quenching)	Immunoway	YS0014
Dilator	Jinzhong	D22178
D-Luciferin	PerkinElmer	122799
DMEM	Gibco	C11995500BT
D-PBS	Solarbio	D1040
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	10270-106
GL261-luc	Shanghai Zishi Biotechnology	N/A
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Life	A21244
Goat Serum	Beyotime	C0265
Hamilton microinjector 10 µL fixed 701N	Hamilton	80383
In vivo bioluminescent imaging (IVIS Spectrum)	PerkinElmer	N/A
Methanol	Fuyu Chemical	67-56-1
Micro Scissors	Jinzhong	WAA320
Microliter Syringes (10 µL, pointed tip)	Shanghai Gaoge	N/A
Microscope cover glass	CITOTEST	10212440C
needle holder 12.5 cm	Jinzhong	JCZ200
Ophthalmic Forceps 10 cm	Jinzhong	JD1060
Ophthalmic Scissors 10 cm	Jinzhong	Y00030
PBS, 10×	Solarbio	P1022
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Scalpel Blades	Jinzhong	J0B050
super pap pen	ZSGB-Bio	ZLI-9303
Surgical Knife Handle	Jinzhong	J11010
Surgical scissors 12.5cm straight tip	Jinzhong	J21010
Nylon Surgical Sutures with thread, size 3-0	UNIFY	N/A
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Triton X-100	Servicebio	GC204003
Trypan Blue Stain Solution, 0.4%	Solarbio	C0040
Trypsin Digestion solutions, 0.25% (without phenol red)	Solarbio	T1350
Tween-20	Solarbio	T8220