אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישת אבלציה בלייזר של שני פוטונים המתבצעת בזחלי דגי זברה, המשמשת מודל לחקר התחדשות העצם והשפעות התגובה החיסונית לאבלציה.

Abstract

לדגי זברה (Danio rerio) יש יכולת יוצאת דופן לחדש איברים ונספחים שונים. התחדשות עצם בדגי זברה נחקרה בשיטות שונות כגון קטיעת סנפירים, מריטת אבנית, טרפנציה של גולגולת וגישות מיקרוסקופיות. באמצעות מערך סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בלייזר דו-פוטון, פותחה שיטת אבלציה בלייזר כפרדיגמת נגע לעיבוד תאים יוצרי עצם (אוסטאובלסטים) באופרקל המתפתח של זחלי דגי זברה. השיטה המתוארת כאן מאפשרת אבלציה של תאים בצורה מדויקת, שכן ניתן לכוונן את השטח, הצורה והעומק בצורה עדינה. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הדמיה של האזור לפני ומיד אחרי האבלציה, כך שניתן לנתח השפעות קצרות טווח של הפציעה. במערך ניסויי זה, נחקרה התגובה החיסונית לאחר אבלציה של אוסטאובלסטים באזור הפגוע. עלייה בגיוס מקרופאגים נצפתה לאחר אבלציה, מה שמצביע על הרלוונטיות של נוכחותם במהלך התחדשות העצם.

Introduction

דגי זברה מחדשים איברים מגוונים כגון הרשתית, המוח, הלב והלבלב¹. בנוסף, דגי זברה מחדשים אלמנטים שלדיים, ולכן הם שימשו לחקר התחדשות סנפירים, קשקשים וקלוואריה (כובעי גולגולת)². פרדיגמות ניסיוניות שונות שימשו לחקר התחדשות רקמות ועצמות, כגון כריתת סנפיר (קטיעה), שבר סנפיר, טרפנציה^{גולגולת 3,4}, קריופציעת קריו-פציעה ^5,6 או אבלציה גנטית ^7,8,9. לאחרונה, גישות אבלציה בלייזר נמצאות בשימוש נרח....

Protocol

פרוטוקול המחקר קיבל אישור מ- Landesdirektion Sachsen, מספרי היתר 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. זני דגי הזברה שבהם נעשה שימוש נשמרו על פי החוק הלאומי ובתנאים סטנדרטיים כפי שתואר קודם לכן^27,28. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים ופתרונות

1. שמור על העוברים במדיה E3 1x. הכן את המדיה 1x E3 על ידי דילול 170 מ"ל של ציר 60x E3 ב 10 L של מים deionized והוספת 2 מ"ל 0.1% methylene כחול.
   1. הכן את מלאי המדיה 60x E3 על ידי ערבוב 17.2 ג....

תוצאות

אבלציה בלייזר בוצעה כמצוין בפרוטוקול לעיל. אות ה-GFP של האוסטאובלסטים באזור האבלטים נעלם מיד לאחר אבלציה. כדי לחקור את התגובה של אבלציה אוסטאובלסט במונחים של התגובה החיסונית, נוכחות של מקרופאגים ב 6 זחלי dpf לפני וב 6 hpl היה תמונה. לפני אבלציה, מעט מאוד מקרופאגים נצפו באזור הא.......

Discussion

אבלציה בלייזר יושמה בתחומים שונים של מחקר ביולוגי. בפרט, זה היה שימושי כשיטה לחקור התחדשות רקמות 10,11,12. לדוגמה, שינויי הגיוס והפנוטיפ של תאי מערכת החיסון המולדת נותחו לאחרונה לאורך זמן באמצעות מבחני אבלציה בלייזר UV או בל.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware