נהלי אימון התנהגותי למציאות מדומה קבועה בראש בעכברים

Summary

המאמר מתאר את הליכי הניסוי עבור פרדיגמת המציאות המדומה (VR) הנפוצה בעכברים, כמו גם קביעת ההיתכנות של הפעלת משימות VR מורכבות על ידי בדיקת משימת אפליית אותות בצורת Y.

Abstract

מציאות מדומה (VR) בשילוב עם קיבוע ראש משמשת יותר ויותר במחקרים במדעי המוח ההתנהגותיים מכיוון שהיא מאפשרת לבצע בדיקות התנהגותיות מורכבות בעכברים קבועי ראש. זה מאפשר הקלטות התנהגותיות מדויקות תוך שילוב טכניקות נוירופיזיולוגיות שונות הדורשות קיבוע ראש כדי למזער רעשי אות הקשורים לתנועה במהלך הקלטות עצביות. עם זאת, למרות השימוש ההולך וגובר ב-VR, יש מעט נתונים שפורסמו על המתודולוגיה המפורטת כיצד ליישם אותה. במחקר זה פותח פרוטוקול אימון לפיו עכברי C57B16/J זכרים ונקבות מאומנים לרוץ במסדרון ליניארי וירטואלי, שאורכו גדל מ-1-3 מ' על פני מספר מפגשי אימון. בהתבסס על בסיס זה, מחקר זה חקר את ההיתכנות של עכברים המבצעים התנהגויות מורכבות בתוך VR באמצעות פרדיגמת מבוך Y. המשימה דרשה ניווט לזרוע עם קירות שחורים מנקודת הבחירה במבוך ה-Y. לאחר שהגיעו לקריטריון של יומיים רצופים השווים או יותר מ-70% נכון, העכברים התקדמו להבחנה חושית קשה יותר ויותר. הממצאים מספקים פרטים חשובים על המתודולוגיות השימושיות לאימון מוצלח של עכברים ב-VR ומדגימים כי עכברים מפגינים יכולות למידה בניווט במבוך Y. המתודולוגיה שהוצגה לא רק מציעה תובנות לגבי משך האימון במבחנים מבוססי VR, אלא גם מדגישה את הפוטנציאל לחקור התנהגויות מורכבות בעכברים, ופותחת דרכים לחקירות מקיפות יותר במדעי המוח.

Introduction

משימות מציאות מדומה התגלו כשיטה רבת עוצמה להערכה התנהגותית בעכברים עקב קיבוע ראש, המאפשר יציבות מכנית שתיפגע בעכברים המתנהגים בחופשיות¹. שיטה זו מאפשרת חפצי תנועה מופחתים בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות ^2,3 והדמיה אופטית ^4,5,6,7. זה גם מקל על התנהגויות חוזרות⁸ ומעקב עיניים מדויק⁹. במערך הניסיוני, העכבר מקובע במקומו וממוקם על גבי הליכון כדורי הנתמך באוויר. מכשיר זה מאפשר חקירה מורכבת של התנהגות מונחית חזותית בסביבת ה-VR. כאשר העכבר נע על ההליכון, התנועה שלו מסתנכרנת בצורה חלקה עם הניווט שלו בתוך הנוף הווירטואלי, המתואר חזותית על המסך המקיף את העכבר.

מטרת מחקר זה היא כפולה: להתמודד עם אתגרים מרכזיים במדעי המוח ההתנהגותיים הניסויים ולתרום לקידום מתודולוגיות בתחום זה. ראשית, למרות השימוש המוגבר ב-VR במחקר אקדמי 10,11,12, נותר היעדר בולט של מתודולוגיות מקיפות ופרוטוקולי הדרכה, מה שמעכב את אימוץ הטכנולוגיה הזו על ידי חוקרים חדשים. המטרה העיקרית הייתה למלא את הפער הזה על ידי התוויית משטר אימונים מפורט לפרדיגמת המסלול הליניארי, כפי שתואר במחקרים קודמים 13,14,15. מערכת זמינה מסחרית משמשת לתיאור נהלים תפעוליים אלה. ככתב ויתור, להנחיות פרוצדורליות אלה יש רכיבים ספציפיים למערכת זו; עם זאת, לדיון בהכללה של פרוטוקול זה, ראה את הדיון. המטרה הייתה לשרטט את ההליכים ההתנהגותיים, את ציר הזמן האופייני לביצוע הליכים אלה, ואת שיעור ההצלחה של אימון עכברים לרוץ במסלול ליניארי פשוט.

שנית, נותר חסר תיעוד על יישום משימות מבוך מורכבות בתוך פרדיגמה זו בעכברים. בדיקות וירטואליות מורכבות פותחו בחולדות¹¹. עם זאת, לעכברים יש חדות ראייה מופחתת בהשוואה¹⁶ ולעתים קרובות ביצועים גרועים יותר במשימות מורכבות¹⁷. בעוד שחלק מהחקירות התמקדו במשימות ספציפיות כגון צבירת ראיות או חידוש מרחבי¹⁸, ההתמקדות כאן הייתה בהבהרת מתודולוגיות האימון הנדרשות לעכברים לעסוק בפרדיגמות קבלת החלטות בסביבות VR. כדי להתמודד עם אתגר זה, תוכננה משימת הבחנת אותות שבה העכברים הוטלו אך ורק ללמוד לשייך את הצבע/בהירות (שחור לעומת לבן) של הזרוע המתוגמלת עם התגמול, שהושגה על ידי בחירת הזרוע השחורה בנקודת הבחירה של מבוך ה-Y, כאשר הזרוע הנכונה חולקה באופן אקראי בכל ניסוי. משימה זו תוכננה לדרוש אינטראקציה עם הרמזים הווירטואליים ולספק תובנה לגבי יכולות ההבחנה התפיסתית של העכברים.

לסיכום, מחקר זה מתייחס לפערים קריטיים בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים הניסויים על ידי מתן פרוטוקולי הכשרה מקיפים לשימוש בפרדיגמות VR בעכברים והבהרת מתודולוגיות למשימות קבלת החלטות מורכבות במסגרת זו. על ידי מינוף תובנות ממחקרים קודמים ועיצובים ניסויים חדשניים, מחקר זה נועד לייעל את שיטות המחקר ולקדם את ההבנה של מנגנונים עצביים העומדים בבסיס ההתנהגות. הסעיפים הבאים יעמיקו בהליכי הניסוי ובתוצאות וידונו בממצאים.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים נערכו תוך הקפדה על הפרוטוקולים שנקבעו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIEHS, תוך הבטחת עמידה בסטנדרטים אתיים והנחיות רווחה. עכברי C57BL/6Tac, בני כ-8 שבועות, שימשו למחקר.

1. ניתוח להשתלת מוט ראש

1. הכנה לניתוח
   1. השג את הכמות הרצויה של עכברים עבור הקבוצה שלך, באופן אידיאלי לשכן אותם בנפרד כדי למזער את ההפרעה לשתל מוט הראש, אם כי זה אופציונלי¹⁹. מחקר זה השתמש בגודל מדגם של שלושה עכברים זכרים ושלוש נקבות (בתחילה מאוזן, אך זכר אחד לא נכלל בשלב מוקדם באימון לאחר שלא הצליח לרוץ על הכדור)
   2. רכוש את החומרים המפורטים בטבלת החומרים, תוך התאמה בהתאם לפרטים של עיצוב המחקר.
   3. עם רכישת העכברים, ייעד מזהים בודדים והחל קעקועי זנב או אגרופים באוזניים כדי להבטיח זיהוי חד משמעי. צור יומן מקיף כדי לרשום באופן שיטתי את משקלם כנדרש להליך הגבלת המים.
2. מתן הרדמה
   1. ודא שכל המכשירים הכירורגיים זמינים, כולל מזרקים מתאימים, כרית חימום, כלי מתכת (כגון פינצטה, מספריים מיקרו והמוסטטים), תמיסת יוד, חומר סיכה לעיניים וכוסות למי מלח ומי חמצן. כדי להבטיח תנאים סטריליים, יש לחטא את כל הציוד הכירורגי ולעקר את כל הכלים הכירורגיים באמצעות חיטוי.
   2. לפני שתמשיך בניתוח, בצע מדידות משקל מדויקות של העכברים והפעל את כרית החימום ל-34 מעלות צלזיוס. רשום את כל המידע הדרוש במחברת המעבדה/כירורגיה של המוסד. ודא את הלימות רמות מיכל החמצן והאיזופלורן ואשר את זמינותם של כל החומרים החיוניים כדי להקל על הליכים כירורגיים ללא הפרעה.
   3. קשקשו את העכבר והניחו אותו בתוך אף המחובר למכשיר אידוי המיועד לבעלי חיים קטנים המקבלים 4% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 3 ליטר לדקה כדי לגרום להרדמה. השתמש בנבלות כדי ללכוד גזי פסולת שעלולים להזיק (מומלץ).
   4. יש לתת משחה וטרינרית עיניים פטרוליום לעיני העכבר כשהוא מתחת לקונוס האף כדי למנוע יובש בעיניים. יש למרוח טיפה אחת על כל עין בהתחלה ולמרוח מחדש לפי הצורך. הקפידו על הגנה מתמדת על העיניים על ידי שמירה תמיד על שכבה של חומר סיכה זה עם בדיקה תקופתית.
   5. הכן את אתר הניתוח (איור 1A) על ראש העכבר על ידי גילוח האזור שבו הגולגולת תוצמד למוט הראש.
   6. מקם את החותכות של העכבר בתוך המנגנון הסטריאוטקסי מתחת לקונוס האף, התאם את קצב זרימת החמצן ל-1 ליטר לדקה ומתן 1%-2% איזופלורן מהוופורייזר. הקפידו על זרימת הרדמה נכונה על ידי התאמת השסתומים ומעבר בין אף האינדוקציה למנגנון הסטריאוטקסי בהתאם. הארך את רגלו האחורית של העכבר והפעל לחץ חזק על הבוהן. אם כף הרגל אינה מציגה תגובת נסיגה רפלקסיבית, הדבר מצביע על כך שההרדמה יעילה. יש לחזור על הפעולה כל 15 דקות, יחד עם בדיקת נשימה.
   7. אבטח את ראש העכבר במקומו על ידי הצמדת מוטות יציבות כירורגיים בתוך תעלות האוזן שלו, תוך מזעור כל תנועת ראש פוטנציאלית במהלך הניתוח.
   8. לפני ביצוע חתכים או זריקות, יש לעקר את אזור הניתוח המגולח בחלק העליון של הראש על ידי קרצוף בעזרת מטוש טבול בחומר חיטוי יוד. משלב זה ואילך, השתמש בכפפות סטריליות כדי לשמור על תנאים אספטיים.
3. ניהול הזרקה
   1. יש להזריק תת עורית 0.05 מ"ל של בופיבקאין (משכך כאבים מקומי) עם מחט 25G לתוך אתר החתך הניתוחי בקרקפת.
   2. הזרקה תת עורית של 1 מ"ל מי מלח (הידרציה) עם מחט 25G לצד אחד של האזור הבין-שכמי.
   3. יש להזריק תת עורית 0.05 מ"ל של בופרנורפין (משכך כאבים לכל הגוף) עם מחט 25G לצד הנגדי של האזור הבין-שכמי.
4. חשיפת הגולגולת
   1. השתמשו במספריים זעירים כדי ליצור חתך של העור מעל התפרים הבין-מצחיים והבין-עיניים של הגולגולת, החל ממש מעל רכס הגבות ועד מאחורי החריץ העורפי (איור 1A).
   2. השתמש בהמוסטטים כדי להחזיק את הדשים השמאלי והימני של העור, ולחשוף את הגולגולת.
   3. השתמש במקלון צמר גפן יבש כדי להסיר רקמת חיבור מהקרקפת בין קפלי העור המוצמדים לאחור.
   4. השתמש במקלון צמר גפן רטוב (אך לא רווי) במי חמצן כדי לקרצף את הקרקפת, להבטיח נראות של התפרים ולהיזהר שלא להכניס מי חמצן לרקמה שמסביב.
   5. חזור על שלבים 1.4.3 ו-1.4.4, 2x-3x, עד שגם ברגמה וגם למבדה נראים בבירור, והקרקפת מנוקה ביסודיות.
5. השתלת בורג כירורגית
   1. חבר שני ברגים לגולגולת, מקם בורג אחד אחורי לברגמה והשני קדמי ללמבדה (איור 1B) כדי למקסם את שטח הפנים עבור דבק דנטלי ולהגדיל את יציבות מוט הראש. מקם את מיקום הברגים במטרות במרחק מוגדר מברגמה. ודא שבורג אחד ממוקם משמאל והשני מימין (כלומר, קדמי-אחורי (AP) +1.00, מדיאלי-לרוחב (ML) -1.00 ו-AP -3.00, ML +3.00), וודא שיש מספיק מקום בין הברגים כדי להתאים למיקום מוט הראש ולהתאים את הקואורדינטות והדרושים.
   2. קדחו את מיקומי המטרה, וודאו שהקידוח מוגבל לעצם הגולגולת ואינו חודר לרקמת המוח.
   3. בעזרת מברג, הברג בערך מחצית מהבורג למקומו. חזור על הפעולה עבור הבורג השני.
6. הצמדת שתל מוט הראש
   1. ערבבו מלט דנטלי והניחו אותו על הצד התחתון של מוט הראש, תוך התמקדות במשטח הקעור, ומרחו לאורך התפר הבין-קדמי של הגולגולת.
   2. מקם את מוט הראש מעל התפר הבין-מצחי כדי להקל על ההדבקה בין המלט הדנטלי על מוט הראש לזה שעל התפר. החזק אותו היטב במקומו ביד בזווית הרצויה למשך כ-5 דקות עד שהוא מתייצב. מרחו מלט דנטלי נוסף לפי הצורך. (איור 1C-E)
7. חיבור מחדש של העור מעל מוט הראש
   1. שחרר את ההמוסטטים והשתמש בפינצטה כדי לאחד מחדש את שני דשי העור מעל מוט הראש הקבוע במלט דנטלי מיובש. השתמש בדבק רקמות מקומי כדי לאבטח בעדינות את העור יחד על ידי הדבקה איטית של החלקים השמאלי והימני של הקרקפת יחד מעל מוט הראש, החל ממקום החתך הקדמי וכלה באתר החתך האחורי.
   2. אפשר לדבק הרקמה המקומי להתקשות כדי לאשר שאזור הניתוח נאטם מחדש לפני שחרור העכבר ממוטות היציבות והחרוט הניתוחי.
   3. העבירו את העכבר לכלוב בודד והניחו אותו על כרית חימום בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס.
   4. עקוב בקפידה אחר העכבר לאיתור סימני אי נוחות או אי סדירות בנשימה עד שהוא יחזור להכרה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר לשכיבה על החזה, מפגין ערנות ונייד.
   5. לאחר הליכים כירורגיים, אפשר לעכברים לעבור תקופת מנוחה של שבוע. עקוב אחר העכברים מדי יום כדי לזהות ולטפל בתנודות בולטות במשקל. ספק מחית לעכברים 3 ימים לאחר הניתוח כדי לסייע בהחלמה. כדי למנוע הפרעה למוט הראש, שכן את העכברים הללו בנפרד.

2. הגבלת נוזלים

הערה: הגבלת מים גורמת למצב של צמא בעכברים, ומגבירה את המוטיבציה שלהם לתגמולים נוזליים. עם זאת, יש צורך ביישום קפדני כדי להבטיח שמירה על רווחת העכברים²⁰.

1. שבוע אחד מיום הניתוח, קבע משקלים בסיסיים לעכברים.
2. הדביקו קטע אחד של צלחת פטרי קטנה (60 מ"מ x 15 מ"מ) עם הצד הקעור כלפי מטה על רצפת הכלוב, והדביקו צלחת פטרי קטנה יותר (35 מ"מ x 10 מ"מ) קעורה כלפי מטה למרכז המשטח השטוח של צלחת הפטרי המודבקת לרצפה, עם צלחת פטרי קטנה נוספת (60 מ"מ x 15 מ"מ) קעורה מודבקת על גבי המשטח השטוח של הצלחת האמצעית כדי לשמש כמאגר מים (איור 2).
3. ודא שגובה המנה העליונה מונע זיהום מחומר המצע תוך מתן גישה נוחה לעכברים למים. הוסף את נפח קצבת המים היומי למאגר באמצעות פיפטה.
4. ביום הראשון, ספקו לעכברים מנה של 15 מ"ל מים לכל 100 גרם מסת גוף.
5. ביום השני, ספקו לעכברים מינון של 10 מ"ל מים לכל 100 גרם מסת גוף.
6. ביום השלישי יש לספק לעכברים מנה של 5 מ"ל מים לכל 100 גרם מסת גוף. עכברים צריכים לקבל צריכה מינימלית של 1 מ"ל מים ליום לאורך כל המחקר, ללא קשר למשקל הגוף.
   הערה: חוקרים עשויים לבחור לנהל את הנפח המינימלי באופן אחיד בכל הנבדקים, אם כי התאמות כאלה צריכות להיעשות בזהירות.
7. שמור על מינון עקבי לאורך כל המחקר של הקצאת המים על 5 מ"ל לכל 100 גרם משקל גוף (או הקצאת מים אחידה של 1 מ"ל אם מעדיפים)
   הערה: יש לספק לעכברים גישה חופשית למים למשך 1-2 ימים בשבוע כאשר עכברים אינם מבצעים ניסוי VR (כלומר, במהלך סוף השבוע). זה יקל על שיקום רמות ההידרציה הטבעיות שלהם. במקרים שבהם עכברים נופלים מתחת ל-90% ממשקל הבסיס המתועד שלהם, יש לעבור לגישה למים אד-ליביטום עד שהם מגיעים ל-90% ממשקלם הבסיסי. עכברים הנופלים מתחת ל-80% ממשקל הבסיס המתועד שלהם צריכים לעבור המתת חסד אתית.
8. דחו את מתן מנת המים היומית שלהם לפחות 30 דקות לאחר הערכה התנהגותית כדי להפחית הפרעות פוטנציאליות להתנהגויות הצמא הטבעיות שלהם החיוניות לביצוע הניסוי בצורה מדויקת.
   הערה: מתן תגמולים נזילים מיד לאחר הניסוי עלול להשפיע שלא במתכוון על ביצועי העכברים, מכיוון שהם עשויים לצפות לקבל תגמול מיידי, מה שעלול לפגוע במעורבות במשימה. לכן, עיכוב הגישה למים לאחר הניסוי מונע התרגלות למתן תגמול מיידי ושומר על שלמות מערך הניסוי.

3. הגדרת מערכת

1. היכרות עם ציוד: לרכיבי החומרה ושיקולים אחרים של מערכות התנהגות VR ראה את השלבים הבאים.
   ראה סעיף דיון לבחינת הכללת פרוטוקול להגדרות מערכת דומות.
   1. תצוגה או כיפה וירטואלית סוחפת לחלוטין: תצוגה וירטואלית זו מספקת חוויה סוחפת לחלוטין לבעל חיים בסביבה וירטואלית הניתנת להתאמה אישית. התנועה בתוך הסביבה הווירטואלית מסונכרנת עם התנועה על ההליכון הכדורי.
   2. מערכת תגמול נוזלי: מערכת התגמול הנוזלי פועלת באמצעות אספקת חיזוק נוזלי (מים או מי סוכר) באמצעות משאבה פריסטלטית, המכוונת את תמיסת התגמול דרך צינור מתכתי מצופה פלסטיק המשתרע לעכבר כאשר משימה מבוצעת בהצלחה. הוא מכיל חיישנים המנטרים את כמות התגמולים שהשיג עכבר במהלך ניסוי.
      1. נקו את שפופרת התגמול מדי שבוע באמצעות אלכוהול אתילי או חומר ניקוי חלופי. לשם כך יש לשטוף 2-5 מ"ל של חומר הניקוי דרך הצינור, בדומה לאספקת תגמול נוזלי, ואחריו שטיפה דומה עם נפח מים שווה.
      2. בעת תחילת הניסוי, קבע את קצב החלוקה של התגמול הנוזלי מצינור התגמול על ידי הפעלתו למשך זמן מוגדר ומדידת נפח הנוזל המחולק. הליך זה מאפשר לקבוע את קצב אספקת הנוזלים של המשאבה הפריסטלטית. במחקר זה נעשה שימוש בקצב חלוקה של כ-0.0083 מ"ל לשנייה.
         הערה: רוב המערכות מציעות הגדרות ניתנות לתכנות למשך הזמן שבין ביצוע ההתנהגות לשחרור התגמול, מה שמאפשר תכנון מדויק של פרוטוקול המחקר בהתבסס על נפח התגמול המיועד לכל ניסיון. הכמות ששימשה נקבעה כמספיקה מכיוון שהיא אפשרה לעכבר זמן מספיק לצרוך את התגמול, ונראה שהנפח שלה היה מניע.
      3. פרוטוקולים מסוימים עשויים לדרוש מהעכבר ללקק את פיית התגמול כדי ליזום משלוח תגמול. עבור סוג המשימות שהועסקו כאן פונקציונליות זו לא הופעלה, ספק תגמולים המותנים אך ורק בביצוע מוצלח של ההתנהגות הרצויה (כלומר בחירת הזרוע הנכונה במבוך y). זה עוזר למנוע כישלונות בשלב מוקדם באימונים שבהם הנטייה ללקק לא התבססה מספיק, והסבירות שהליקוק הראשוני יתרחש נמוכה יותר. זה גם יכול לאפשר מדידה של תוחלת התגמול, שניתנת לניתוק מביצועי ניווט בתנאים מסוימים¹¹.
      4. בעוד שחלק מהניסויים המשתמשים בהגבלת נוזלים בוחרים בשימוש במים סטנדרטיים דרך צינור התגמול, כאן השתמשו במי סוכר (10% סוכרוז v/v) כגירוי מוטיבציוני נוסף בתוך הפרדיגמה האופרנטית. יש לציין כי ביצועים משופרים על פני מספר קבוצות ניסוי נצפו עם הכנסת מי סוכר.
   3. כדור קלקר: כדור זה משמש כהליכון כדורי. כאשר מרופדים באוויר מלמטה, אימנו את העכברים לרוץ או ללכת בנוחות על הכדור. מקם אותו על גבי מחזיק כדור המצויד בחיישני מעקב אחר תנועה האוספים נתונים על מרחק ומהירות.
   4. מחזיק ראש: מקם את המכשיר מאחורי העכבר, והבטח יישור חזותי עם תצוגת ה-VR בעת הצמדת מוט הראש למחזיק. מכשיר זה חיוני לשמירה על העכבר במצב קבוע בראש, ובכך להפחית חפצי תנועה, במיוחד כאשר המערכת משמשת לצד הדמיה אופטית או טכניקות אלקטרופיזיולוגיות.
   5. חומרת זרימת אוויר: הגדר את זרימת האוויר ממקור אוויר דחוס לכדור ליצירת סביבה חסרת משקל התורמת לעכברים שרצים על הכדור. הגדרה זו דורשת ווסת זרימה כדי להבטיח שליטה מדויקת על לחץ האוויר המופעל על הכדור. הכדור פועל ביעילות בסביבה חסרת משקל עם אספקת אוויר מינימלית. לכן, במהלך הגדרת המערכת, ודא את כמות האוויר המינימלית הדרושה כדי לאפשר תנועה חלקה וללא הפרעה של הכדור בתוך המחזיק. מומלצת זרימה בין 10-20 ליטר לדקה.
2. הגדרת תוכנה: לפרטים ספציפיים על פעולת המערכת, ראה להלן.
   הערה: בדומה לעיצוב של משחקי וידאו²¹, הארכיטקטורה של עולמות וירטואליים משלבת אלמנטים מרכזיים כגון בקר חיצוני, סביבה ניתנת לתכנות הניתנת לניווט וקובץ לוח זמנים המכיל דיאגרמת מצב המתארת פונקציות דינמיות. מרכיבים אלה מתכנסים באופן סינרגטי ליצירת חוויה אינטראקטיבית מגובשת עבור נבדקים העוסקים במחקרים. היעילות התפעולית של התוכנה תלויה בארגון קבצים מדויק בתוך תיקיות ייעודיות. הסבר זה יתאר את השלבים העיקריים הדרושים לאכלוס תבניות מוכנות מראש, מה שיאפשר התאמות קלות לקבצים קיימים ושמירתם כגרסאות חדשות. גרסאות חדשות אלה יהוו את הבסיס למחקר.
   1. השתמש בשלושת הקבצים הבאים יחד כדי לקבוע תצורה של נוף וירטואלי תפעולי.
      1. קבצי XML: פורמט קובץ זה מספק למשתמשים את היכולת לתפעל את מרקם הצילום של אלמנטים שונים כגון השמיים, הרצפה והקירות. מקם את הקבצים ששימשו לתמונות בתיקיית המשנה Data של תיקיית המציאות המדומה. באמצעותם, ציין את מידות המבוך וקבע את המיקום ההתחלתי של העכבר בתוך המבוך. הגדר אובייקטים תלת מימדיים (רמזים חזותיים) בצמתים מסוימים בתוך המבוך באמצעות קבצים אלה. שנה קבצים אלה באמצעות עורך טקסט.
      2. קבצי XLSX: קבצי אלה פועלים כקבצי הפקודה המגדירים את כל שלושת סוגי הקבצים (XML, XLSX ו- XAML) יחד ליצירת מצגת וירטואלית מגובשת ואינטראקטיבית. השתמש בקבצים אלה כדי להגדיר את שגרות הניסוי שמפעילות את ה-VR ואת האביזרים שלו, כגון רגישות הגברה, אילו נתונים מחולצים ואילו קבצים מקובצים יחד לניסוי.
      3. קבצי XAML: יישום התוכנה מספק ממשק גרפי ליצירת לוחות זמנים ניסיוניים באמצעות שימוש בתרשימי זרימה. זה מקל על הגדרת פרמטרים זמניים לניסוי, בקרות לטלפורטציה לאחר השלמת הניסוי ותזמון ההפעלה של פלטים דיגיטליים במסגרת הניסוי.
   2. השתמש ביישומים הבאים לרכישת נתונים ובקרת המשתמש במערכת בזמן שהיא פועלת.
      1. [יישום] VR: המשויך לקובץ .XML שמציג את הנוף המייצג, פתח את הקובץ כדי להציג תצוגה מקדימה של הנוף הווירטואלי על המסכים במצב סטטי. לאינטראקציה דינאמית, פתח את התצורה המותאמת. XLSX ביישום הבקרה.
      2. פקד [יישום]: המשויך לקובץ .XSLX, פתח יישום זה כדי לראות את התקני האביזרים המשויכים למערכת. אפשר להאריך ולמשוך ידנית את שפופרת התגמול, לחלק תגמול נוזלי ולצפות ברכישת נתונים בזמן אמת מכאן.
      3. מעצב לוחות זמנים [יישום]: יישום זה מספק את היכולת להתאים קבצי XAML כדי לקבוע לוח זמנים להפעלת אירועים בתוך הניסוי. לדוגמה, תכנן טריגר הניתן להתאמה אישית כדי לקבוע את משך הזמן לחלוקת תגמולים ולהגדיר את משך ההפסקות בין ניסויים לעכברים.
3. סטארט-אפ לדוגמה: התחל בהחלטה כיצד ייראה פרוטוקול המחקר על סמך הרכיבים המתכווננים משלבים 3.2.1.1-3.2.1.3. לאחר שפרוטוקול אופרנטי מוגדר בבירור, פתח את אחד מניסויי התבניות שהגיעו מוגדרים מראש עם מערכת ה-VR על ידי ביצוע השלבים הבאים.
   1. פתח את יישום ה-VR, שנפתח לתיקיית המשנה נתונים. שמור את הנוף הווירטואלי שנוצר כקובץ XML. פתח את הקובץ הזה, והנוף הווירטואלי אמור להופיע על צגי ה-VR.
   2. פתח את היישום Control ונווט אל פתח תיקייה סמל בפינה השמאלית העליונה של המסך. לחץ על הסמל, שאמור להעלות את תיקיית התצורות, שבה המתאים . תצורה ניסיונית XLSX ממוקמת. פתח את קובץ . XLSX עם שם זהה לקובץ .XML שנפתח באפליקציית ה-VR. אביזרי המערכת המוגדרים, כמו המשאבה והמנוע עבור התקן התגמול הניתן להרחבה, גלויים כעת תחת לשונית הבקרה בתוך היישום.
   3. התחל את הניסוי הניסיוני, שכן התיאום בין שני היישומים הללו מאפשר יצירת נוף וירטואלי אינטראקטיבי. בסופו של דבר, אינטגרציה זו מאפשרת ניטור של נתונים חיוניים, כולל מרחק במישור XY ואיסוף תגמולים עם חותמות זמן.
4. רכישת נתונים: חלץ את הנתונים ההתנהגותיים החשובים ביותר מהמערכת, שהם נתוני מיקום ותגמולים עם חותמת זמן. נתונים אלה נשמרים בנפרד כקבצי יומן רישום.
   1. נתוני פוזיציה: כדי להשיג זאת, בצע את השלבים המתוארים להלן.
      1. כדי להשיג נתוני מיקום XY עם חותמת זמן של העכברים, פתח תחילה את קובץ הגיליון האלקטרוני של מבוך רכישת הנתונים הרצויים. בטבלה 1, שים את הפקודה WriteVRAndCamInfoToFile באחד התאים מתחת לאחרים בעמודה A. כעת, נתוני מיקום יישמרו כקובץ CSV מתוארך (בשם Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv) באופן אוטומטי בתיקיית התצורות לאחר ניסיון.
      2. כדי לייצא את נתוני המיקום לאחר ניסיון, סגור את יישום הבקרה והנתונים יישמרו בקובץ CSV מתוארך. קובץ זה יכיל את כל הנתונים הספציפיים ליום מסוים, לכן הקפד לציין ידנית מתי כל נבדק הונח על הכדור והורד ממנו. פתח את הקובץ וייבא אותו באמצעות ערכת התווים Unicode UTF-8. עמודה A נקראת DateTime, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכרטיסייה A ולחץ על עיצוב תאים. עבור אל זמן ולחץ על האפשרות MM/DD/YYYY HH:MM: SS . כעת, כל אירוע מערכת יקוטלג בסדר כרונולוגי להמשך ניתוח נתונים.
   2. נתוני תגמול: כדי להשיג זאת, בצע את השלבים המתוארים להלן.
      1. נתונים על הפעלת המשאבה (חלוקת תגמול) נשמרים אוטומטית כקבצי יומן מתוארכים במערכת, כך שאין צורך להכניס פקודה כמו שעושים עבור נתוני המיקום. כדי לגשת אליהם, עבור אל תיקיית המשנה קבצי יומן של תיקיית התצורות.
      2. חזור על שלב 3.4.1 לנתוני מיקום עבור נתוני התגמול כדי לייצא את הנתונים כקובץ גיליון אלקטרוני. פתח את תיקיית התצורות ובחר את קובץ התגמול המתוארך (בשם Corridor- MM.DD.YYYY או Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY) כאשר הוא מוצג בתיקיה. זה יספק את התאריך והשעה שבהם העכברים רכשו את התגמולים, ואפשר להשתמש בזה בניתוח נתונים נוסף בהתאם לפרדיגמה שהם השתמשו בה.

4. משימות התנהגותיות

הערה: בהתאם למתודולוגיות מבוססות במדעי המוח ההתנהגותיים, המשימות המנוסחות משתמשות בטכניקת למידה אסוציאטיבית מבוססת תגמול. על ידי שימוש בתגמולים מיידיים לחיזוק התנהגויות ספציפיות, בעלי חיים מאומנים ביעילות לבצע משימות שחוזרות על עצמן, המתאפשרות על ידי יכולת הטלפורטציה של VR. במסגרת התנהגותית וירטואלית, פונקציונליות טלפורטציה מעניקה לעכברים את היכולת לעסוק במשימות ללא הלחץ הקשור למניפולציה פיזית, ובמקביל מפחיתה את משך ההתקנה הדרוש למשימות אנלוגיות בעולם האמיתי. במהלך האימונים, השתמש בתאורה עילית אדומה עמומה במסגרת הניסוי. אמצעי זהירות זה מומלץ בשל הרגישות התפיסתית החזותית המופחתת של עכברים לאור אדום, מה שמפחית הפרעה פוטנציאלית לתפיסתם את מסכי המציאות המדומה (VR), בניגוד לשימוש באור לבן²².

1. התרגלות
   1. התחל את ההתרגלות להליכון הכדורי במקביל להתרגלותם לוויסות נוזלים כדי לקשר את צינור הליקוק לתגמול באמצעות המוטיבציה הפיזיולוגית המתוזמנת נכון. מומלצת תקופת הרגלה של שלושה ימים לפני תחילת אימון המסלול הליניארי.
   2. ביום^הראשון , טפל בעכברים במשך 5 דקות לאחר השקילה. במהלך אינטראקציה זו, מומלץ לתפוס בעדינות את שתל מוט הראש בזמן שהעכברים נמצאים בכלוב שלהם, וליצור היכרות עם מניפולציה כזו. הציגו בפניהם את האזור שבו שוכן ה-VR ביום זה כדי לאפשר להם לצפות את הסביבה המרחבית שבה יתרחשו ניסויים ניסיוניים. יום ההתרגלות הראשוני הזה עולה בקנה אחד עם התחלת ויסות נוזלים של 15 מ"ל לכל 100 מ"ג מסת גוף.
   3. ביום^השני , שמתיישב עם המעבר לשלב ויסות נוזלים של 10 מ"ל ל-100 מ"ג מסת גוף, טפל שוב בעכברים למשך 5 דקות. המשיכו לאחוז בעדינות חוזרת ונשנית במוט הראש בעודכם בכלוב. הצמד את מוט הראש למחזיק תוך מתן אפשרות לעכברים להכיר את ההליכון הכדורי למשך 5-20 דקות, בין אם במסלול חוזר אינסופי או ללא הפעלת התוכנה. זה מקל על הסתגלותם למצב קבוע בראש. יש לצפות כי עכברים עשויים להפריש פסולת במהלך תקופה זו, שבדרך כלל פוחתת במהלך מפגשים עוקבים.
   4. ביום^השלישי , המתאים ליום האחרון של פרדיגמת ויסות הנוזלים (5 מ"ל לכל 100 מ"ג מסת גוף), טפל בעכברים למשך 5 דקות. לאחר מכן, חבר אותם היטב להליכון הכדורי המרופד באוויר והכניס אותם לתגמולים נוזליים דרך צינור התגמול.
      1. הצגת פיית הליקוק לעכברים תמימים תבלבל אותם בהתחלה, אז ודא שהעכבר מודע לכך שהם אמורים לשתות מהצינור.
   5. מבלי להיות חזק מדי, החל את המיקום של הנחיות העכבר למטה והתאם אישית את מיקום העכבר על הכדור ביחס לצינור באופן שיספק להם את התגמול בצורה נוחה. כשאתם מתחילים, וודאו שהעכברים שותים מהצינור; זה יתרחש ברוב העכברים באופן טבעי בתנאים מוגבלים במים כאשר מציגים להם נוזלים לשתייה.
2. מיקום העכברים
   1. מיקום מראש: לפני הנחת העכבר על הכדור, הרחיבו את צינור התגמול הממורכז עם טיפת תגמול קטנה בקצה. הארך את צינור התגמול לפני מיקום העכבר על הכדור כדי למנוע כל פציעה פוטנציאלית הנובעת מהארכת הצינור בשוגג קדימה מדי ברגע שהעכבר מקובע בראשו. הרם את צינור התגמול 5-15 מ"מ מעל ההליכון הכדורי כך שליקוק הפיה דורש יציבה טבעית של הראש הפונה קדימה.
   2. קיבוע ראש: כדי לתקן את העכבר, הנח את העכבר על הצד הדומיננטי של המטפל בהליכון הכדורי. לאחר מכן, בעזרת היד הדומיננטית של המטפל, משוך את העכבר במוט הראש שלו לכיוון פלטפורמת קיבוע הראש. הנח את מוט הראש בחריץ המיועד לקיבוע, ולאחר מכן באמצעות היד הלא דומיננטית של המטפל, לחץ על מוט הראש למקומו.
   3. מיקום על הכדור: התאם אישית את המיקום על ההליכון הכדורי עבור כל עכבר, אך ודא שהם עומדים בדרישות הבאות כדי להבטיח מוטיבציה לטעימת התגמול ולמזער את רמות הלחץ הכוללות.
      1. מרפדים את המישור האמצעי של העכבר במרכז ההליכון הכדורי. במקרים בהם מוט הראש אינו ישר, ודא שהמישור האמצעי של העכבר, ולא מוט הראש, נמצא בקו אחד עם מרכז המיקום. לבהירות חזותית, ראה איור 3C.
      2. ודא שהכפות האחוריות של העכבר אינן יותר מ-11 ס"מ מקודקוד ההליכון הכדורי ושהראש נמצא מאחורי הקודקוד. ודא שכל ארבע הכפות נוגעות בהליכון ושהבטן יכולה לגעת בהליכון כאשר העכבר במנוחה; זה יתמוך בהליכה נכונה ויציבות על הכדור לריצה.
      3. כאשר עכברים לא רצים, זה נקרא סירוב כדור. אם העכברים ממשיכים לקפוא ולא מנסים לרוץ, סביר להניח שהם חווים חרדה מוגזמת, ומכיוון שהחוקר בוחר להוציא אותם מהניסוי. במחקר זה, נעשה שימוש בסף כמותי של 5 ימים של סירוב לכדור כדי לקבוע אי הכללה מהנתונים.
   4. הטיית צד: כאשר עכברים מתחילים להתרגל לשגרת האימונים, הם יעדיפו צד אחד על פני השני. זה יכול להפריע לביצוע המשימה, לכן הקפד לוודא שכל העדפת צד אינה נובעת מאסימטריה באופן שבו החיה מורכבת על הכדור. משימת מבוך ה-y המופעלת כאן דורשת מהחיה לבצע בחירות ימין ושמאל כדי לייעל את מסירת התגמול, מה שמקל על התגברות על העדפות צד.
   5. זרבובית תגמול: גישה זו כוללת תמרון עדין המכונה שיטת kiss it, שבו העכבר מונחה לעבר צינור הליקוק המורחב עד שפיו כמעט נוגע בקצה הזרבובית, ובכך מבטיח מסירה מדויקת של התגמול. הגדר את משך צינור התגמול המורחב לשנייה אחת כאשר עכברים מקבלים תגמולים, מה שמאפשר לעכבר זמן מספיק לצרוך את הטיפה במלואה. התאם אישית את מיקום פיית הליקוק עבור כל עכבר, מכיוון שהגודל והמיקום המועדף עבור כל עכבר בודד עשויים להיות שונים. ודא שצינור התגמול נשאר מרוכז לאורך כל הניסויים לסטנדרטיזציה של ליקוק; העכבר תמיד צריך לצפות לקבל את התגמול באותו מיקום פיזי ללא קשר לעיצוב המבוך הווירטואלי.
      הערה: בעוד שקביעת משך זמן זה נתונה לשיקול דעתו של החוקר, ממצאים אלה מצביעים על כך שמסגרת זמן זו הייתה יעילה בהקלת צריכת תגמול מלאה על ידי העכבר לפני נסיגת הצינור. איור 3B מציג דוגמה למיקום מועדף למיקום.
   6. מסלול ליניארי: בהתאם למחקרים קודמים המשתמשים במתודולוגיות דומות, השתמש במשימת מסלול ליניארי כדי לחקור שתי שאלות מרכזיות: הזמן הנדרש לאמן עכברים לחצות מסדרון ישר ושיעור ההצלחה הצפוי של רכישת תגמול על ידי עכברים.
      1. ודא שעכברים הסתגלו הן לפרדיגמת הגבלת הנוזלים והן לחומרה הניסיונית.
      2. בצע הפעלה יומית של 30 דקות כדי לנוע לאורך מסדרון וירטואלי ליניארי המתחיל באורך של 1 מ'. כשמגיעים לסוף המסדרון ומקבלים את פרס טיפות הסוכר, טלפורט את העכברים בחזרה לנקודת ההתחלה.
      3. קבע התקדמות מבוססת קריטריונים למבוכים ארוכים יותר (למשל, 1 מ', 2 מ', 3 מ'). קדמו את העכברים לאורך המבוך הבא אחרי שהשיגו יומיים רצופים של קבלת 2 תגמולים לדקה בממוצע (איור 4A).
      4. תעד הקלטות יומיות של נתונים עם חותמת זמן הנוגעים לאחזור תגמול, והמרחק שעברו עכברים על ההליכון הכדורי לניתוח נוסף (איור 4B-D).
      5. עבור עכברים שמקבלים בממוצע 2 תגמולים לדקה על המסלולים הליניאריים של 3 מ', סמנו אותם כמיומנים בפרדיגמת המסלול הליניארי. מומלץ לעכברים להגיע לשלב זה לפני שהם מתקדמים למשימות התנהגותיות מורכבות יותר הדורשות קבלת החלטות.
   7. משימות התנהגותיות מורכבות הדורשות קבלת החלטות (Y-Maze): שלב זה בוחן את היתכנות ההתקדמות ממשימה התנהגותית פשוטה למשימה התנהגותית מורכבת יותר הדורשת קבלת החלטות. כדי להשיג זאת, צור משימת מבוך Y-Maze של אפליית אותות.
      1. בפרדיגמת מבוך Y זו^23,24, ודא שהעכברים מנווטים לעבר נקודת בחירה שבה שתי זרועות משתרעות 45° לכל כיוון כמו צורת Y. השבת את הסיבוב מנקודת ההתחלה של המבוך עד הגעה לנקודת הבחירה, שתי זרועות בצבע משתנה, ולאחר מכן הפעל אותו בתוך אזור ההחלטה כדי לאפשר לעכבר להסתובב לכיוון הרצוי.
      2. עם הכניסה לזרוע המובילה לאזור התגמול, השבת את הסיבוב פעם נוספת. זרוע שחורה מייצגת את הנתיב הנכון, בעוד שזרוע לבנה מייצגת את הנתיב השגוי. השתמש בזרוע השחורה ובזרוע הלבנה כרמזים כדי להתאים למגבלות פוטנציאליות בחדות הראייה של העכבר מכיוון שניתן להבחין ביניהם בקלות, מה שמקל על בחינת השימוש שלהם במידע חזותי בצורתו הפשוטה ביותר.
      3. אמן את העכברים לנווט לעבר הזרוע השחורה כדי לקבל פרס סוכר, כאשר כל ניסוי מסתיים בכך שהעכברים משוגרים בחזרה למקום ההתחלה. שלבו בתכנון הניסוי ערבוב אקראי של מיקום התגמול בין הצד השמאלי והימני, כדי להבטיח שעכברים יקשרו את התגמול לרמזים החזותיים ולא לצד הספציפי.
      4. השתמש באותם שלבים להגדרת מבוך Y כמו המסדרון הליניארי. שקף את הקריטריונים להתקדמות בפרדיגמת מבוך ה-Y לאלה של המסדרון הליניארי: כל ניסוי נמשך 30 דקות, ועכברים צריכים להגיע לסף תגמול שנקבע מראש במשך יומיים רצופים. מומלץ סף של 70% תגמולים שנרכשו כהלכה על סמך הביצועים הממוצעים של קבוצות פיילוט קודמות במבוך Y; הוא נמצא מעל סף הסיכוי (50%), והוא מייצג אחוז סביר שניתן להשיג המעיד על כך שעכברים מבינים את המשימה (איור 5A).
      5. עם הגעה לנקודת הבחירה, ודא שהעכבר בוחר אחת מהזרועות הנכונות או השגויות. בקצה הזרוע, טלפורט אותה בחזרה לנקודת ההתחלה כדי לחזור על המבוך תוך מסגרת זמן של 30 דקות.
      6. גישה זו השתמשה בגישה בהשראת פסיכופיזיקה חזותית, שבה המבוכים נעשו מאתגרים יותר ויותר להבחנה. עקבו אחר התיאור שלהלן להתקדמות בפרדיגמת מבוך ה-Y.
         1. במבוך ה-Y הראשוני, הציגו זרועות שחורות ולבנות מוצקות בנקודת הבחירה של המבוך. אם העכבר בחר נכון את הזרוע השחורה במשך 70% מהניסויים במשך יומיים רצופים, התקדם לרמה הבאה עם משימות אפליה מאתגרות יותר ויותר. כדי להשיג זאת, הכניסו בהדרגה 10% נוספים מהצבע המנוגד לכל זרוע בכל רמת התקדמות. לדוגמה, העבירו את הזרוע הלבנה להיות מורכבת מ-90% לבנים ו-10% שחורים, ולהיפך, מה שהופך את ההבחנה לתובענית יותר עם כל התקדמות.
            הערה: הרעיון להגדלה הוא שאם ניתן להגיע ל-50% לבן/שחור, זו תהיה שליטה יעילה מכיוון שלא ניתן יהיה להבחין בין הזרועות. אולם הרחוק ביותר שהעכברים הצליחו להבחין לרעה היה 80%:20% (איור 5B).

תוצאות

מחקר פיילוט זה נועד להתוות מתודולוגיות לאימון יעיל של עכברים בשתי משימות נפרדות: מסדרון פשוט ומשימת קבלת החלטות מורכבת (משימת ההבחנה החזותית של מבוך Y). נתונים אלה שימשו בסיס לקביעת קווים מנחים זמניים לאימון התנהגותי ב-VR.

השלבים הפרוצדורליים מתחילים בתיאור ההשתלה הכירורגית של מוט הראש באיור 1. שתל זה משמש לייצוב גולגולת העכבר במהלך הערכות התנהגותיות, ובכך משפר את הדיוק של הקלטות עצביות, במיוחד כאשר משתמשים בו בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה או טכניקות הדמיה.

איור 2 ואיור 3 ממחישים את רכיבי החומרה וההגדרה של מערכת הניסוי. איור 2 מפרט את מערכת אספקת המים, שהשתמשה בשיטת מזרקת צלחת פטרי. זה כלל הדבקת צלחת פטרי בגודל 60 מ"מ על 15 מ"מ עם הצד הקעור כלפי מטה על רצפת הכלוב, אבטחת צלחת פטרי קטנה יותר בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ צד קעור כלפי מטה במרכז הצלחת הגדולה יותר, והנחת צלחת פטרי נוספת בגודל 60 מ"מ על 15 מ"מ כלפי מעלה על גבי הצלחת הקטנה יותר כדי לשמש כמאגר מים. גובה הצלחת העליונה הותאם בקפידה כדי למנוע זיהום על ידי חומר מצע תוך הבטחת גישה נוחה לעכברים למים.

איור 3 מציג את חומרת המערכת והנחיות מיקום העכבר. איור 3A מתאר את מערך ה-VR, שהציג מערך של שישה מסכים עם הליכון כדורי הממוקם במרכז. איור 3B מציג את המיקום האופטימלי של העכבר על ההליכון, כאשר הראש מיושר במצב טבעי וכל ארבע הכפות במגע עם המשטח. איור 3C משווה מיקום נכון ושגוי של עכבר ביחס למוט הראש, ומדגיש כי המישור האמצעי של העכבר צריך להיות ממורכז, במקום ליישר קו עם מוט הראש עצמו.

איור 4 מציג עקומות רכישת תגמול על גרף קו, הממחיש את תקופות הלמידה הצפויות עבור מסדרונות צרים של 1 מ', 2 מ' ו-3 מ' ב-VR בהתבסס על פרמטרים מוגדרים מראש להתקדמות. הוא מתאר את המהירויות הממוצעות של עכברים לאורך המסלולים המתאימים, ומדגים עלייה הדרגתית במהירות כעדות ללמידת משימות ושיפור בהתאם לקושי מוגבר. מוצג גם גרף עמודות הממחיש את מספר הימים הממוצע הנדרש לעכברים כדי להגיע לקריטריון עבור המסלולים הליניאריים, כמו גם גרף עמודות המציג מהירויות ממוצעות עבור כל אורך מסלול. לאחר מכן, מומחשים גם השלבים המתקדמים של משימת המסלול הליניארי שנלמדו על ידי העכברים. משימות אלו נועדו לשכפל מתודולוגיות שנקבעו בספרות האקדמית תוך הבטחת עקומת למידה אפשרית לעכברים, מה שמקל על התקדמותם ברמות.

לבסוף, איור 5 מספק נתונים הנוגעים למשימת מבוך Y. האיור ממחיש את האופי המתקדם של המשימה, החל מהבחנה ישירה בין זרועות שחורות ולבנות. שלב ראשוני זה משמש כצעד מכונן, המבסס את יכולתם של העכברים להבחין בין רמזים חזותיים מנוגדים. רמות עוקבות של המשימה מציגות מורכבות הולכת וגוברת על ידי שילוב אחוזים נוספים של הצבע המנוגד לכל זרוע, ובכך מאתגרות עוד יותר את יכולות ההבחנה של העכברים. ההגדלה ההדרגתית של קושי המשימה מודגמת על ידי המעבר מזרועות שחורות ולבנות מוצקות לזרועות המורכבות מ-90% מצבע אחד ו-10% מהשני. יש לציין כי הנתונים המוצגים באיור 5 מצביעים על כך שבעוד שדיוק ההבחנה משתפר עם כל רמת התקדמות, חלק מהעכברים מפגינים באופן עקבי סף של יכולת הבחנה חזותית, ומגיעים למקסימום של 80%/20% אפליה בין לבנים לשחורים. תצפית זו מדגישה את המגבלות הטמונות ביכולות ההבחנה החזותית של העכברים בהקשר של משימת מבוך Y, ומספקת תובנות חשובות לגבי היתכנות המשימה והיכולות הקוגניטיביות של הנבדקים. לאחר מכן, מפורטים השלבים המתקדמים של משימת מסלול מבוך Y, שתוכננו ליישר קו עם מתודולוגיות מבוססות בספרות. שלבים אלה הבטיחו עקומת למידה אפשרית עבור העכברים, ותמכו בהתקדמותם ההדרגתית ברמות.

איור 1: הוראות כירורגיות להשתלת מוט ראש. (A) אתר החתך מסומן על הגולגולת של העכבר. (B) יש להשתיל את הברגים 1 מ"מ משמאל לתפר הבין-מצחי מעט מתחת לברגמה ו-3 מ"מ מימין לתפר הבין-מצחי מעט מעל למבדה. (ג) יש למקם את מוט הראש לאורך התפר הבין-מצחי. (ד) מרחו מלט דנטלי על שתל מוט הראש. (ה) הדמיה בפועל של מוט הראש לאחר מריחת צמנט דנטלי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מערכת אספקת מים בשיטת מזרקת צלחת פטרי. צלחת פטרי בגודל 60 מ"מ על 15 מ"מ הייתה קבועה עם הצד הקעור כלפי מטה על רצפת הכלוב. צלחת פטרי קטנה יותר בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ הייתה מרוכזת על הצלחת הגדולה יותר, עם צלחת פטרי נוספת בגודל 60 מ"מ על 15 מ"מ שהונחה בצד הקעור כלפי מעלה כדי לשמש כמאגר. מערך זה הבטיח שהמים יישארו לא מזוהמים על ידי מצעים ונגישים לעכברים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: חומרת מערכת ומיקום הנחיות העכבר. (A) זה מציג את הגדרת ה-VR שבה נעשה שימוש. נעשה שימוש במערך של שישה מסכים, כאשר ההליכון הכדורי הוצב באמצע. (B) מבט מהצד של מיקום העכבר האופטימלי על ההליכון הכדורי. ראש העכבר נמצא במצב טבעי, בעוד שכל ארבע הכפות נמצאות על ההליכון הכדורי. (ג) מבט למעלה על מיקום נכון לעומת שגוי של העכבר ביחס למוט הראש. למיקום נכון, המישור האמצעי של העכבר צריך להיות מרוכז ולא מוט הראש עצמו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נתוני מסלול ליניאריים. (A) הנתונים המוצגים מתארים את התגמולים היומיים שנאספו בכל תקופת ניסיון של 30 דקות. עכברים התקדמו לאורכי מסלול ארוכים יותר לאחר שהשיגו בממוצע 2 תגמולים לדקה במשך יומיים רצופים, בסך הכל 60 תגמולים (סף). (B) כאשר עכברים רכשו מיומנות במשימה, המהירויות שלהם הראו עלייה הדרגתית, מה שמעיד על היעילות של חיזוק התגמול. הגרף ממחיש את המהירות היומית הממוצעת של כל עכבר על המסלול בס"מ לשנייה, ומתאר התקדמות ליניארית בהתנהגות הנלמדת. (ג) גרף עמודות זה ממחיש את משך הזמן שלוקח לכל עכבר לרכוש מיומנות באורכי מסילה בודדים, עם האמצעים ושגיאת התקן המתאימים המתוארים עבור כל אורך רצועה. (D) גרף עמודות זה מדגים את הממוצע ואת שגיאת התקן של המהירויות היומיות הממוצעות שהושגו על ידי כל עכבר באורכי מסלול שונים. ההתקדמות הכמעט ליניארית מרמזת על שיפור נלמד במהירות הריצה. (ה) זה ממחיש את התקדמות משימת המסלול הליניארי, הדורשת 2 ימי ניסיון רצופים של 60 תגמולים לפני התקדמות לגרסה ארוכה יותר של המבוך. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: נתוני Y-Maze. (A) זה מראה את התפלגות התגמולים שנרכשו בשלבים שונים של התקדמות מבוך Y. ניתוח זה התמקד אך ורק בתת-קבוצה של ארבעה עכברים שהשלימו את כל שלבי המסלול הליניארי, ובכך הבטיחו ייצוג שוויוני של משתתפים גברים ונשים כאחד. (B) הייצוג החזותי הזה ממחיש את השלבים של מטלת מבוך Y, שבה עכברים מתקדמים לאחר השגת יומיים רצופים של 70% בחירות נכונות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מחקר זה השתמש בגישה מקיפה לחקירת התגובות ההתנהגותיות של עכברים בסביבות VR, תוך התמקדות ביישום פרוצדורות כירורגיות, פרוטוקולי הגבלת נוזלים, הגדרת מערכת ומשימות התנהגותיות. ממצאים אלה תורמים לתחום על ידי מתן פרטים פרוצדורליים, מסגרות זמן להכשרה ושיעורי הצלחה. זה יאפשר אימוץ יעיל יותר של נהלי VR בעכברים ויקל על תכנון ויישום עבור מעבדות המעוניינות להשתמש בהליך זה במחקר שלהן.

ההשתלה הכירורגית של מוטות ראש הייתה חיונית להקלה על ניסויים התנהגותיים קבועים בסביבות VR. על ידי הקפדה על פרוטוקולים שנקבעו ומתן טיפול מתאים לאחר הניתוח, הובטח שילוב מוצלח של מוטות ראש תוך מזעור ההשפעות השליליות על בריאות והתנהגות בעלי החיים. בנוסף, יושמו פרוטוקולי הגבלת נוזלים כדי לווסת את צריכת המים ולשמור על רמות ההידרציה והצמא בקרב העכברים. תהליך ההתאקלמות ההדרגתי והגישה התקופתית למים היו חיוניים להבטחת רווחת בעלי החיים תוך הקלה על ביצוע משימות התנהגותיות.

ההגדרה של מערכת התנהגות ה-VR כללה שילוב של רכיבי חומרה ותוכנה ליצירת סביבות וירטואליות סוחפות עבור העכברים. השימוש בתצוגות וירטואליות סוחפות לחלוטין, מערכות תגמול נוזליות, כדורי קלקר כהליכונים כדוריים ומחזיקי ראש אפשרו שליטה מדויקת על תנאי הניסוי ורכישת נתונים. משימות התנהגותיות, כולל פרדיגמות המסלול הליניארי ומבוך Y, תוכננו בקפידה כדי לחקור היבטים מרכזיים של התנהגות עכברים, כגון תנועה, קבלת החלטות ועיבוד תגמול.

למרות מיטב המאמצים לייעל את הליכי הניסוי, נתקלו במספר אתגרים במהלך המחקר. שונות בתגובות עכברים בודדים ובעיות טכניות הקשורות לשילוב חומרה ותוכנה הציבו אתגרים לאיסוף וניתוח נתונים. בנוסף, ההסתמכות על פרוטוקולי הגבלת נוזלים חייבה ניטור קפדני של מצב ההידרציה של החיה והתאמת נהלי הניסוי בהתאם. לפעמים, עכברים נאבקו כאשר הם מונחים על הכדור, לא שתו מזרבובית התגמול, או קפאו ולא רצו על הכדור. למרות שחלק מהאתגרים הללו עשויים להיות זמניים, חיוני לעקוב אחר העכברים כדי לוודא שהם אינם חווים מכשולים בהתקדמותם. יש להוציא מהמחקר עכברים שאינם מצליחים להראות התקדמות בהשוואה לעמיתיהם. בניסוי דומה הוסרו 4 מתוך 55 עכברים בגלל חוסר היכולת שלהם ללמוד את הפרדיגמה²⁵. עכברים שהפגינו חוסר תנועה עקבי על הכדור במשך 5 ימים רצופים לא נכללו במחקר לאחר הערכות יסודיות של משקלם, יכולתם לגשת לפיית התגמול לשתייה ומיקום על הכדור כדי להבטיח שלא היו בעיות בסיסיות. במקרים אלה, זה נתון לשיקול דעתו של החוקר להחליט איזו אסטרטגיה לנקוט כדי לחדש את המחקר ביעילות.

פרוטוקולי אימון אלה נועדו לאתגר בהדרגה את העכברים תוך הבטחת מיומנותם בביצוע משימות התנהגותיות. הקריטריונים להתקדמות מהמסלול הליניארי לפרדיגמת מבוך ה-Y התבססו על יכולתם של העכברים לעמוד בספי ביצועים שנקבעו מראש, כגון השגת ימים רצופים של ניסויים מוצלחים ורכישת תגמול. היישום של פרוטוקולי אימון קפדניים אפשר לנו להעריך את יכולות ההתנהגות של העכברים ואת יכולת ההסתגלות שלהם למשימות מורכבות יותר ויותר. פרוטוקולים מובנים בקפידה אלה מספקים מסגרת חזקה לחוקרים בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים, ומציעים גישה שיטתית להערכה ואימון בעלי חיים לפרדיגמות ניסוי מגוונות. על ידי התוויית קריטריונים ברורים להתקדמות, חוקרים יכולים לאמוד ביעילות את עקומת הלמידה של נבדקים ניסויים ולאצור פרדיגמות הכשרה בהתאם. יתר על כן, גישה מתודולוגית זו מטפחת שחזור וסטנדרטיזציה על פני ניסויים, מקלה על ניתוחים השוואתיים ומקדמת את ההבנה של תהליכים קוגניטיביים ומנגנוני למידה במודלים של בעלי חיים.

בעת תכנון פרדיגמת VR לעכברים, חיוני להכיר את מגוון הגישות הזמינות לגבי מורכבות המשימה והתקדמות האימון. פרוטוקול זה מציע מסגרת רחבה לבניית תכנון ניסוי, אך נותר לחוקר להתאים היבטים ספציפיים כגון מתן תגמול, בקרת הטיה, סוג גירוי, התקדמות משימה ופרמטרים מערכתיים בהתאם לצרכי המחקר. לדוגמה, חלק מהמחקרים בוחרים בגישה יעילה יותר, המתמקדת במעורבות מיידית במשימה. דוגמה לכך היא Krumin et al. שהטמיעו משימת מבוך T אחת ועקבית במקום להשתמש במשטר למידה מתקדם בין משימות שונות. לעומת זאת, מחקרים אחרים מציעים מרכיבי תכנון ניסוי מגוונים, כגון אסטרטגיות חיזוק גירוי ורמזים שמיעתיים. המחקר השתמש במשוב שמיעתי כעונש על ניסויים שגויים וסיפק רק מים כפרס על ניסויים נכונים²⁶. לעומת זאת, ג'או ועמיתיו השתמשו בתמיסת סוכרוז של 10% כפרס על ניסויים נכונים ולא כללו שום צורה של ענישה על ניסויים שגויים²⁷. במקום זאת, הם התמקדו בהפחתת תגובות שגויות באמצעות שיטות כמו אימון נגד הטיות, שכללו הגדלת ההסתברות לשנות את כיוון הרמז מהבחירה הקודמת של החיה והתאמת מכסת המים היומית כדי להגביר את המוטיבציה. הבדלים בתכנון הניסוי, כגון נוכחותם של רמזים מרחביים לאורך המשימה, יכולים להוביל לפרשנויות שונות של קידוד עצבי, כפי שמעידים Zhao et al. מציאת סלקטיביות של תאי קליפת המוח הקודקודית האחורית המוסברת על ידי מסלולים והעדפות מרחביות, בניגוד לרצפי ההפעלה תלויי הבחירה שנצפו על ידי Harvey et al.^27,28. חשוב לציין שהחומרה הספציפית ששימשה כללה שישה מסכי LCD, פיית ליקוק הניתנת להארכה והליכון כדור קלקר מרופד אוויר. ישנם מספר הבדלים בין מערכות מציאות מדומה בין מעבדות, כולל שימוש במקרנים²⁹ לעומת צגי מחשב, הליכונים לא כדוריים^{30 ו-10} קבועים לעומת פיות ליקוק הניתנות להארכה.

לסיכום, מחקר זה מספק תובנות חשובות לגבי התגובות ההתנהגותיות של עכברים בסביבות VR ומדגים את ההיתכנות של שימוש בטכנולוגיה סוחפת כדי לחקור התנהגויות מורכבות. מאמצי מחקר עתידיים עשויים להתמקד בחידוד פרוטוקולים ניסיוניים, חקר מנגנונים עצביים העומדים בבסיס תהליכי קבלת החלטות ותרגום ממצאים ליישומים קליניים. על ידי המשך קידום ההבנה של התנהגות עכברים, מדענים יכולים להבהיר עוד יותר את המעגלים העצביים והתהליכים הקוגניטיביים העומדים בבסיס התנהגויות מורכבות הן בבריאות והן בחולי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube