מודל עכברי בעל יכולת חיסונית לטיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר בגליובלסטומה

Summary

גליובלסטומה היא צורה הרסנית של סרטן מוח ראשוני, וטיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר מתגלה כחלופה מבטיחה לכריתה כירורגית קונבנציונלית לגליובלסטומה שאינה ניתנת לניתוח. פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר פרה-קליני אופטימלי שניתן להשתמש בו כדי לחקור את השפעות הטיפול או טיפולים משלימים וקומבינטוריים.

Abstract

גליובלסטומה (GB), הצורה האגרסיבית ביותר של סרטן מוח ראשוני, מהווה כמחצית מכל גידולי המוח הראשוניים בדרגה גבוהה במבוגרים ואין לה תרופה. טיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר (LITT) הוא טיפול מאושר על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) ל-GB ומשמש בחולים שאינם מועמדים לכריתה כירורגית קונבנציונלית. בעוד שהיעילות הקלינית של LITT הוכחה, מחקר מעבר למחקרי מקרה קליניים וסדרות מקרים מוגבל ומעוכב על ידי היעדר מודל מבוסס של בעלי חיים. פרוטוקול זה משתמש בעכברי C57BL/6 ובקו תאי סרטן גליומה CT2A סינגני כדי לסכם מקרוב את ה-GB האנושי תוך שימוש בלייזר 1064 ננומטר Yttrium Aluminum Garnet (Nd:YAG) מסומם ניאודימיום, כגון המשמש באחת משתי מערכות LITT שאושרו על ידי ה-FDA, המספק רלוונטיות פרה-קלינית מצוינת. הקמתו המוצלחת של מודל עכברי LITT זה תספק פלטפורמה רבת ערך לחקירת המאפיינים הייחודיים של אבלציה של LITT והשפעותיה על מיקרו-סביבת הגידול, מה שעשוי להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.

Introduction

סרטן הוא גורם המוות המוביל מספר אחת בקנדה. גליובלסטומה (GB), הצורה הנפוצה ביותר של גידול מוח אגרסיבי, מהווה 48% עד 60% מכלל גידולי המוח הראשוניים בדרגה גבוהה במבוגרים¹. הפרוגנוזה ל-GB עגומה במיוחד עם הישרדות נטו של 5 שנים של 4.8% עם טיפולים קונבנציונליים, כולל כריתה כירורגית, כימותרפיה והקרנות ^1,2.

טיפול תרמי אינטרסטיציאלי בלייזר (LITT) הוא הליך שאושר על ידי ה-FDA באמצעות לייזר לאבלציה היפרתרמית של גידול במקום בחולים עם גידולי מוח שאינם ניתנים לניתוח ומספק אלטרנטיבה טיפולית אטרקטיבית לכריתה כירורגית קונבנציונלית³. עם זאת, חסר מודל עכברי מפורט ומאופיין היטב לטיפול ב-LITT ב-GB, מה שמעכב מחקר פרה-קליני.

פרוטוקול זה נועד להציג מודל עכברים פרה-קליני אופטימלי לטיפול ב-GB עם LITT. בחרנו להשתמש בעכברי C57BL/6 ובקו תאי הגליומה הסינגני CT2A עבור מודל זה בעיקר מכיוון ש-CT2A מסכם מקרוב GB אנושי בדרגה גבוהה עם מאפיינים היסטולוגיים דומים, פולשניות, עמידות לכימותרפיה ולרדיו, ותכונות דמויות גזע עם חידוש עצמי והקמה מחדש של גידולים⁴. מאפיינים אלה מספקים פלטפורמה מצוינת למגוון מחקרים הכוללים תגובות חיסוניות או אסטרטגיות טיפוליות חדשות. יתר על כן, ההיבטים הטכניים של פרוטוקול LITT זה ניתנים להתאמה בקלות גם למודלים אחרים של עכברי אלוגרפט וקסנוגרפט ^4,5,6, שיידונו בהמשך.

היתרונות של פרוטוקול זה כוללים תוצאות עקביות עם פרדיגמת טיפול פשוטה אך יעילה של LITT. לייזר 1064 ננומטר מסומם ניאודימיום איטריום אלומיניום גרנט (Nd:YAG) המשמש זהה לזה המשמש קלינית באחת משתי המערכות המאושרות כיום על ידי ה-FDA, ומאפשר ניסויים המקבילים מאוד ליישום הקליני של LITT לטיפול בגליומה בדרגה גבוהה. החיסרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הזהירות הקיצונית שיש לנקוט הן במהלך השתלת תאי הגידול והן במהלך הטיפול ב-LITT כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. בנוסף, בשל האופי האגרסיבי של קו התאים CT2A, הפרוטוקול רגיש מאוד לזמן. רוב הניסויים יצטרכו להסתיים תוך 20 יום לכל היותר, מה שעשוי להגביל את החקירות של תגובות חיסוניות אדפטיביות מסוימות או מנגנונים תאיים ומולקולריים אחרים המתרחשים לאורך זמן ארוך יותר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

אתיקה של בעלי חיים לפרוטוקול זה אושרה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מניטובה בהתאם להנחיות האתיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). פרוטוקול זה השתמש בעכברים בעלי יכולת חיסונית C57BL/6 בני 8-12 שבועות וקו תאי גליומה סינגני CT2A למודל פרה-קליני עם מגוון רחב של יישומים, כולל ניסויים המתמקדים בניתוח היסטולוגי, שינויים אימונולוגיים או התערבויות טיפוליות קומבינטוריות. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות למיני עכברים אחרים או לקווי תאים על סמך דרישות הניסוי.

איור 1: סכימה גרפית של תכנון ניסוי בסיסי. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת תאים בקצרה (יום 0)

1. לפני שתתחיל בתרבית התאים, ודא שהארון וכל הפיפטות הנדרשות מעוקרים לחלוטין עם UV ואתנול.
2. חממו את ה-DMEM/F12 עם 10% מדיה FBS, תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) וטריפסין לטמפרטורת החדר (RT) באמצעות אמבט מים.
3. הוציאו את המדיה מבקבוק ה-T25 ושטפו לזמן קצר את התאים עם PBS. מוסיפים 1 מ"ל טריפסין לתאים ודוגרים במשך 30-60 שניות עד שהתאים מתנתקים מהבקבוק.
4. אשר את התאים המנותקים תחת מיקרוסקופ אור והוסף 4 מ"ל מדיה כדי לעצור את הפעילות האנזימטית של הטריפסין.
5. ספור תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
   1. מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף התא עם 10 מיקרוליטר של טריפאן כחול, ואז מוסיפים 10 מיקרוליטר לשקופית ספירת התאים.
   2. הכנס את השקופית למכונת ספירת התאים ורשום את ספירת התאים הכוללת, ספירת התאים החיים ואחוז התאים החיים.

הערה: אם מכונת ספירת תאים אוטומטית אינה זמינה, ניתן לבצע ספירה ידנית באמצעות המוציטומטר.

6. חשב את התאים הנדרשים לכל הזריקות המתוכננות.
   הערה: עבור CT2A, מומלץ 5000 תאים לכל 1.5 מיקרוליטר בנפח מוזרק ומינימום של 100 מיקרוליטר נפח כולל לכל תכשיר.
7. סובב את התאים ב-134 x גרם למשך 5 דקות כדי לגלול את התאים ולשאוף כמה שיותר מדיום.
8. השעו מחדש את גלולת התא עם תמצית קרום הבסיס של 5% ב-PBS עבור הנפח הדרוש בצינור מיקרו-צנטריפוגה. בעוד שצינורות קטנים יותר יתאימו ביותר להכנת תרחיף התאים, צינור של 2 מ"ל עדיף לאחסון במהלך הניתוח מכיוון שהתאים נוטים פחות להתגבש לתחתית המעוגלת יותר ולהתפזר מחדש בקלות בתנועה עדינה.
9. שמור תאים על קרח להזרקה, והכן תרחיפי תאים טריים כל 4-5 שעות לפי הצורך.

2. השתלה אורתוטופית (יום 0)

1. הכן את אזור הניתוח וודא שכל המכשירים הנדרשים סטריליים ומוכנים לשימוש.
2. הרדמת עכבר באמצעות איזופלורן (3% אידוי ב-1 ליטר/דקה O₂) בתא תוך ניטור קצב הנשימה (יעד 60 פעימות לדקה).
3. השג ורשום משקל בעל חיים למינון תרופות.
4. גלח את אזור הניתוח בזהירות כדי להימנע מהעיניים, האוזניים והשפם.
5. העבירו את החיה למסגרת סטריאוטקטית.
   1. הנח חותכות בחור של מוט הנשיכה והתאם את החרטום עד שהוא צמוד, הדק את בורג השמירה כדי לאבטח.
   2. בדוק את עומק ההרדמה עם צביטות בבוהן דו-צדדית בגפיים האחוריות, ובמידת הצורך, אבטח את הגולגולת באמצעות סיכות אוזניים והתאם את ראש החיה למצב ניטרלי במישור ישר.
   3. עקוב אחר טמפרטורות הליבה של בעלי החיים באמצעות בדיקת טמפרטורת פי הטבעת משומנת וספק התחממות משלימה ב-37 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום מתחת לגוף.
      זהירות: הקפד לא להדק יתר על המידה את החרוט, מכיוון שאפילו לחץ מתון על עצם האף עלול לגרום לדום נשימה. אם נעשה שימוש בכרית חימום חשמלית (למשל, כרית חימום לטרריום), ודא שהגדרות הטמפרטורה מדויקות והטמפרטורה שנקבעה נשארת קבועה.
6. יש למרוח משחת עיניים בנדיבות על שתי העיניים כדי למנוע יובש.
7. יש לתת זריקות מונעות ולבדוק את עומק ההרדמה.
   1. יש להזריק מלוקסיקם תת עורי (s.c.) או תרופות אחרות לשיכוך כאבים ארוכי טווח בהתאם להנחיות המקומיות לבעלי חיים (למשל, 5.0 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם) באמצעות מזרק 28 גרם x 1/2 אינץ'.
   2. יש לתת זריקה של 20 מ"ג/ק"ג s.c. מי מלח רגילים שחוממו מראש לתמיכה בנוזלים מונעים במהלך פרוצדורות ארוכות יותר.
   3. הפחיתו את חומר ההרדמה ל-1.5%-2.0% איזופלורן כדי לשמור על קצב נשימת היעד.
8. בעזרת טכניקה אספטית, עטפו את החיה והכינו את אזור הניתוח.
   1. בעזרת צמר גפן סטרילי יש למרוח תמיסת חיטוי פובידון-יוד או כלורהקסידין. התחל מדיאלית במקום החתך וסיבוב הספוגית לאחר כל מעבר, עבד כלפי חוץ, ולאחר מכן בעזרת צמר גפן סטרילי טרי, מרח 70% אתנול על האתר בצורה דומה.
   2. יש לחזור על הפילינג עם יוד ואחריו 70% אתנול פעמיים נוספות (3 פעמים בסך הכל, כל אחת).
9. בדוק שוב את עומק ההרדמה לפני שתמשיך בחשיפה הכירורגית. עקוב מקרוב אחר קצב הנשימה לאורך כל ההליך והתאם את חומר ההרדמה לפי הצורך.
10. החל מקו האמצע ומעט אחורי לעיניים, בצע חתך באמצע הסגיטלי של 1-1.5 ס"מ בכיוון הזנב באמצעות אזמל להב #15. לחלופין, יש להאריך חתך אזמל קצר בעזרת מספריים לקשתית.
    הערה: החתכים צריכים להתחיל בקו האמצע, אך עבור הזרקות חד צדדיות, עשויים להיות בזווית מעט לרוחב כדי להקל על הדמיה וגישה בו זמנית של ברגמה ומיקום חור הבור.
11. בעזרת צמר גפן סטרילי, שקפו את קצוות הפצע כדי לדמיין את הגולגולת ושפשפו בעדינות כל רקמת חיבור מהאזור.
    1. במידת הצורך, השתמש במקלון צמר גפן סטרילי ספוג במי חמצן כדי לנקות את פני הגולגולת ולדמיין את תפרי הגולגולת.
12. אתר את ברגמה במקום שבו התפרים העטרתיים השמאלי והימני נפגשים בקו האמצע עם התפר הסגיטלי (ראה איור 2).
    1. בעזרת שרף אקרילי צבעוני לא רעיל וקיסם עץ סטרילי או דומה, השאירו סימן קטן מאוד על ברגמה.
       הערה: במקרים מסוימים, התפרים העטרתיים השמאלי והימני אינם משקפים זה את זה; במקרים כאלה, השתמש ב'קו ההתאמה הטובה ביותר' כדי להעריך היכן הם צריכים להצטלב לאורך המישור האמצעי הסגיטלי.
13. ודא שתנוחת הראש של החיה אינה מוטה או מסובבת (כלומר, במישור שטוח).
    1. אפס קואורדינטות סטריאוטקטיות בברגמה. קואורדינטת ה-x מתייחסת לתנועה במישור המדיאלי-רוחבי (ML), קואורדינטת ה-y במישור הקדמי-אחורי (AP) וקואורדינטת ה-z במישור הגבי-גחוני (DV).
    2. ודא שלמבדה נמצאת באותו מישור DV כמו ברגמה (כלומר, z = 0 בשני ציוני הדרך). באופן דומה, ב-+2.0 מ"מ (x = 2) ו-2.0 מ"מ (x = -2.0) לרוחב לברגמה, ודא שהגולגולת נמצאת באותו מישור, כאשר קואורדינטת ה-DV/z שווה בערך. ודא שהגולגולת מאובטחת ואינה זזה לאחר התאמות כלשהן.
14. קדחו חור בור ב-+2.0 מ"מ (ML) ו-+0.5 מ"מ (AP) מבית Bregma (איור 3).
    1. בעזרת חיבור מקדחה סטריאוטקטית, הורד בזהירות את קצה הביט עד שהוא יוצר מגע עם ברגמה ואפס את הקואורדינטות.
    2. הרם מעט את הביט והתאם את המקדחה לקואורדינטות AP ו-ML המתאימות.
    3. הורד את המקדחה לאט, הקפד לחפור רק דרך הגולגולת.
    4. לחלופין, באמצעות מזרק מיקרוליטר במסגרת הסטריאוטקטית, הורד את נקודת המחט עד שהיא נוגעת בברגמה ואפס את הקואורדינטות.
    5. הרם מעט את המחט והתאם לקואורדינטות AP ו-ML המתאימות.
    6. הורד את הקצה עד שהוא נוגע בגולגולת ורשום את המיקום המדויק.
    7. הרם מעט את המחט וסימן קטן במיקום היעד בעזרת טוש כירורגי.
    8. הרם או סובב את מנשא המחט מהדרך, ובעזרת מקדחה ידנית, חפור דרך הגולגולת, היזהר להימנע מפגיעה במוח שמתחתיו. זהירות: באופן כללי, לעכברים זכרים מבוגרים יש גולגולות עבות יחסית ודורשים קידוח נרחב יותר. יש לבצע קידוח ידני בזהירות, תוך הפעלת לחץ מינימלי, שכן פרצות פתאומיות דרך הגולגולת יפגעו בקרום המוח ו/או במוח הבסיסיים.
       הערה: יש צורך בהארכה של חור הבור כדי להכיל את בדיקת הצמד התרמי במהלך הליך LITT. ניתן לעשות זאת ביתר קלות במהלך ניתוח ההזרקה הראשוני ומאפשר ניתוח LITT מהיר ויעיל יותר. לחלופין, ניתן להרחיב את החור באותו אופן במהלך ניתוח LITT, מה שעשוי להפחית את הסיכון לצמיחת גידול חוץ-גולגולתי.
15. צור חור שני ב-+3.0 מ"מ ML ו-+0.5 מ"מ AP (1.0 מ"מ לרוחב אתר ההזרקה) עבור הצמד התרמי.
    1. בצע את הליך הקידוח כמתואר בשלב הקודם.
    2. כדי למנוע קשיים הקשורים לצמיחה מחדש של העצם, הסר את העצם בין שני החורים.
       הערה: מומלץ להשתמש ב-+2.0 מ"מ ML, +0.5 מ"מ AP ו-2.5 מ"מ DV מ-Bregma כקואורדינטות להשתלת גידול. מיקום זה בסטריאטום העליון מניב צמיחה עקבית של הגידול, אשר נסבלת היטב על ידי בעלי החיים - עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול למקומות אחרים.
16. הכן תרחיף תאי גליומה של עכבר CT2A במזרק מיקרוליטר (5000 תאים ב -1.5 מיקרוליטר).
    1. הסר את צינור התאים המיקרו-צנטריפוגה שהוכן מראש מהקרח והחליק בעדינות עם קצה האצבע כדי להשעות מחדש.
    2. שאב בעדינות 2 מיקרוליטר למזרק של 5 מיקרוליטר או 10 מיקרוליטר תוך הקפדה על הימנעות מבועות.
    3. אקספרס 0.5 מיקרוליטר כדי להסיר אוויר ולהבטיח שהמחט מוכנה ופועלת כהלכה.
    4. נגב את פיר המחט עם ספוגית אלכוהול כדי להסיר את הנוזל המתבטא ואת כל התאים על פני השטח החיצוניים (מה שעלול לגרום לצמיחת גידול לפטומנינגאלי).
17. טען את המזרק למשאבת מזרק מיקרו-מזרק (או חיבור סטריאוטקטי ידני) והורד לאט את המחט.
    1. הורד את המחט לאט לעומק (z = -3.0 מ"מ) והשהה למשך דקה אחת.
    2. משוך לאט את המחט 0.5 מ"מ (z = -2.50 מ"מ) והזריק תאים (≤ 0.5 מיקרוליטר לדקה). שמור על האזור סביב המזרק יבש באמצעות חנית ספוג מיקרו-כירורגית, היזהר לא לשבש את המחט.
    3. המתן לפחות 2 דקות לאחר השלמת ההזרקה, ולאחר מכן משוך לאט את המזרק במשך תקופה של 3-4 דקות. ודא שמרווחי הנסיגה הראשונים של 4-5 הם 100 מיקרומטר לכל נסיגה כדי למנוע עקירת תאים מאתר ההזרקה המקורי שלהם.
    4. בעזרת ספוגית אלכוהול, נגב בעדינות את החלק החיצוני של המחט נקי מכל דם או נוזל ושטוף ונקה את המזרק בהתאם להנחיות היצרן. השתמש ב-PBS ובמים מזוקקים בין הזריקות כדי להבטיח שהמחט לא תיסתם. בסיום הזריקות, שטפו את המחט בנדיבות עם 70% אתנול כדי להסיר את כל התאים שנותרו מהמחט.
       זהירות: אי שטיפת המחט לאחר כל הזרקה עלולה לגרום לחסימה. אם מזריקים יותר מסוג תא אחד, השתמש במחט נפרדת לכל סוג כדי למנוע זיהום צולב אפשרי.
18. העריכו מחדש את החתך, הקפידו להזיז מעט את שולי הפצע כך שהדרמיס הבסיסי ייגע. סגור את הפצע באמצעות קליפ פצע או 3 תפרים קטועים עם תפר 5-0. מרחו תמיסת פובידון-יוד על הפצע הסגור.
19. הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקטית והנח אותה בכלוב התאוששות מרופד בנייר על כרית חימום המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס. ודא שמתקבלת שכיבה חזה לפני העברת החיה בחזרה לכלוב הביתי עם צלחת קטנה של צ'או רטוב הממוקמת על רצפת הכלוב.
20. עקוב אחר בעל החיים לפחות פעמיים ביום, החל מיום הניתוח, במשך היומיים הבאים. קרא את מלוקסיקם לאחר 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות, או בהתאם להנחיות המוסד.

איור 2: איור גרפי של גולגולת עכבר וציוני דרך אנטומיים חשובים עבור ניתוחים סטריאוטקטיים. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: איור גרפי המציין מיקומים של בורות ומכשירי לייזר. איור המציג את המיקומים היחסיים של ציון הדרך של ברגמה, (A) חור הבור הראשוני עבור סיב הלייזר (A'), ו-(B) חור הבור השני, או המורחב, עבור בדיקת הצמד התרמי (B'). תיאור חתוך של סיבי הלייזר ובדיקות הצמד התרמי מוצג מימין, הממחיש כיצד הבדיקות מיוצבות בקצה סטריאוטקטי עם חורים שנקדחו מראש בגודל ובמרווח הרצויים. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניטור עומס הגידול לפני LITT (יום 9)

1. בצע הדמיית תהודה מגנטית משוקללת T2 (MRI), בהתאם להנחיות המוסדיות, כדי להעריך את צמיחת הגידול ביום שלפני LITT.
   הערה: הגידולים צריכים להיות בקוטר ~1.5-2.0 מ"מ.
   1. השג סריקה קורונלית מתאימה של כל מוח העכבר באמצעות הפרמטרים הבאים: רצף הד ספין מהיר, TR = 5000 אלפיות השנייה, TE = 45 אלפיות השנייה, רכבות הד = 7, FOV = 30 x 30 מ"מ², גודל מטריצה = 250 x 256, סה"כ פרוסות = 18, עובי פרוסה = 0.3 מ"מ, ממוצעים = 2.
      הערה: מומלץ גם לבצע MRI תקופתי החל מהיום ה-6 לאחר ההשתלה כדי לאשר השתלה מוצלחת ולעקוב אחר צמיחת הגידול - במיוחד במהלך ניסויים ראשוניים - מכיוון שאפילו שינויים עדינים בהליך עשויים לשנות את ציר הזמן. CT2A הוא אגרסיבי מאוד, ויש לעקוב אחר בעלי החיים מקרוב. סריקת קורונל משוקללת T2 עובדת היטב למטרה זו. שימוש בתאי CT2A עם תווית פלואורסצנטית או תווית לוציפרין בשילוב עם מערכת הדמיה in vivo (IVIS) עשוי להתאים גם כאשר גישה ל-MRI של בעלי חיים קטנים אינה זמינה. עם זאת, קינטיקה של גידול ומאפייני גידול אחרים יהיו שונים מפרוטוקול זה.

4. ניתוח LITT (יום 10)

1. כמו לעיל בסעיף 2, חזור על שלבים 2.1-2.13 כדי להכין את החיה ל-LITT.
   הערה: ריפוי פצעים מהניתוח הקודם עשוי להיות בשלבים שונים בהתבסס על מינים ושינויים בציר הזמן של הניסוי. שימו לב לרקמה דקה או עדינה יותר בעת ביצוע מחדש של החתך.
2. בעזרת ספוגית סטרילית עם קצה כותנה, נקו בעדינות את הגולגולת, והסירו כל רקמה שמסתירה את ברגמה או את חור הקוצים שנוצר קודם לכן. במידת הצורך, קדחו מחדש את חור הבור, אם כי בשל מהירות היווצרות הגידול CT2A, צפויה צמיחה מחודשת של העצם מעט אם בכלל.
3. עם חיבור ה-LITT במקומו במסגרת הסטריאוטקטית, אפס את הקואורדינטות בברגמה עבור קצה סיב הלייזר.
   זהירות: סיב הלייזר שביר מאוד וייסדק אם הוא מכופף. הקפד לעצור ברגע שקצה סיבי הלייזר נוגע בגולגולת.
4. הרם מעט את הקצה ועבור לקואורדינטות ה-ML וה-AP הרצויות, ולאחר מכן הורד לאט את הבדיקות לקואורדינטות ה-DV של היעד כדי להגיע למטרה (2.0 מ"מ ML, 0.5 מ"מ AP, -2.0 מ"מ DV).
5. הגדר את פרמטרי הטיפול ב- LITT: מצב: רציף; הספק: 1 וואט
6. העבר את הלייזר ממצב המתנה לפעיל והפעל את הלייזר למשך 60 שניות באמצעות דוושת כף הרגל. אם הטמפרטורה עולה מעבר ל-46 מעלות צלזיוס, עצור לזמן קצר, ולאחר מכן הפעל מחדש, מנסה לשמור על הטמפרטורה קרובה ככל האפשר ל-46 מעלות צלזיוס.
7. החזר לאט את מכלול הלייזר ונגב בעדינות את סיבי הלייזר והצמד התרמי בעזרת ספוגית אלכוהול. סובב את המכלול מהדרך, היזהר שהבדיקות לא ייגעו במסגרת.
8. סגור את הפצע ושחזר את החיה כמתואר בשלבים 2.18-2.20 לאחר השתלת הגידול לעיל.

5. הערכה לאחר LITT (יום 11)

1. בצע MRI משוקלל לאחר LITT T2 ביום שלאחר הטיפול ב-LITT כדי להעריך אבלציה מוצלחת של גידול LITT באמצעות הרצף והפרמטרים משלב 3.1 לעיל.
   הערה: בנוסף, רצף התאוששות היפוך מוחלש נוזל (FLAIR) עשוי להועיל גם בהערכת בצקת לאחר הניתוח.
2. בצע סריקות מעקב לפני סיום המחקר כדי לעקוב אחר שינויים לאחר הטיפול או צמיחה מחודשת של הגידול.

6. סיום הלימודים (יום 11/יום 15/יום 20)

1. המתת חסד של בעלי חיים בנקודות הקצה הניסיוניות שנבחרו בהתאם להנחיות המוסד.
   הערה: נקודות קצה מאוחרות יותר מהיום ה-20 אינן אפשריות עם CT2A, אפילו עם חיסונים עם ספירת תאים נמוכה במיוחד, מכיוון שחיות ביקורת (כלומר, ניתוח דמה או ללא טיפול) וחלק מבעלי החיים בקבוצת הטיפול עשויים להיות גוססים ולדרוש המתת חסד. לניסויים ארוכים יותר, שקול מודלים חלופיים של תאי גליומה של עכבר.
2. אוספים רקמות לקיבוע ועיבוד.
   1. בצע זלוף לב עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ואסוף את הרקמות המעניינות.
   2. לאחר קיבוע רקמת המוח על ידי טבילה ב-4% PFA למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. עבד את הדגימות באמצעות שיטות סטנדרטיות לניתוח משובץ פרפין קבוע בפורמלין (FFPE) או קפוא קבוע.

7. ניתוח

1. אמת אבלציה מוצלחת של LITT באמצעות MRI משוקלל T2 ותקף באמצעות טכניקות היסטולוגיות בסיסיות כגון המטוקסילין וצבע אאוזין.
2. לבצע אנליזות נוספות הנדרשות לניסויים (למשל, אימונוהיסטוכימיה, אימונופלואורסצנטיות).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ניתן לאפיין השתלת גידול CT2A מוצלחת וטיפולי LITT באמצעות MRI משוקלל T2, כפי שמוצג באיור 4, איור 5 ואיור 6. תמונות MR התקבלו באמצעות מגנט מוליך-על נטול קריוגן 7T עם קדח 17 ס"מ וסליל ראש עכבר ריבועי תוך שימוש בפרמטרי הרצף המתואר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנו גוף ספרות המתרחב במהירות בנוגע ל-LITT; עם זאת, הוא מוגבל בעיקר למחקרי מקרה קליניים אנושיים או לסדרות מקרים. ואכן, הוכחו מספר יתרונות פוטנציאליים ל-LITT, כולל שיעורי סיבוכים ועלויות נמוכים יותר לאחר הניתוח תוך הענקת הישרדות ללא התקדמות דומה 7,8,9,10,11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbion Spears	FST	18105-01	Hemostatic sponges.
Adson tissue forceps	FST	11006-12
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	Strain #000664	6 to 12 week old male and female
Cotton Tipped Applicators (6")	Electron Microscopy Sciences	72308
CT2A glioma cell line			Generously donated from Dr. Peter Fecci, Duke University.
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear	Biotechne, R&D systems	3433-010-01
DMEM/F-12, HEPES	Gibco, ThermoFisher Scientific	11330032
Dual-chamber slides	BIO-RAD	1450003
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL	Eppendorf	22363352
Ethyl Alcohol Anhydrous	Greenfield Global	P016EAAN	Dilute to 70% with ddH2O
Fetal Bovine Serum, qualified, Canada	Gibco, ThermoFisher Scientific	12483020
Glad Press-n-Seal plastic wrap	Amazon.ca	12587704417
High speed drill	Kopf Instruments	Model 1474
K & J Thermocouple temerpature meter	Omega	HH509R
Metacam (meloxicam)	WDDC	114424
Microinjection syringe pump	WPI	UMP3T-1
Microliter syringe (700 Series)	Hamilton	87908	Custom needles are available. A steep needle bevel helps with precise delivery, and a shorter needle length helps with stability.
Needle driver/Needle Holder	FST	12500-12	A fine tip is most suitable due to the confined working space, but many styles are suitable based on handle preference.
Opixcare Plus opthalmic ointment	WDDC	135941
Phosphate Buffered Saline (10x)	Fisher bioreagents	BP399-4	Dilute to 1x with ddH2O
Povidone-iodine	ThermoFisher Scientific	3955-16	Aliquat into into smaller tubes for use with cotton tipped applicators.
Saline (normal)	WDDC	126588
Scalpel, single use (#15 Blade)	Feather	Feather NO15
Scissors, fine surgical	FST	91460-11	Fine student scissors, Iris, or Bonn are all suitable.
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 940	With digital display console and mouse nose-cone and ear-bars.
Stereotactic syringe holder	Kopf Instruments	Model 1772-F	If not using an injection pump.
Sutures (5-0 monofilament)	Ethicon	MCP463G	Monocryl violet monofilament with reverse cutting tip
Syringe, 28 G  (0.5 mL)	BD	BD 329461	BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102
Thermocouple probe, fine diameter (Type K)	Omega	TJM-CA316-IM025G-150
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25200072
Vetbond by 3M, veterinary tissue glue	WDDC	126125
Wahl Peanut Clippers	WDDC/Wahl	100963	Also available directly from manufacturer.
Warming pad	Bensen Medical	70308/121873	Any similar item can be used.
Webcol Alcohol preps	Electron Microscopy Sciences	71005-20	Alcohol prep wipe, 2-ply, medium size.