הדמיה תלת מימדית של פריציטים וסקולריים ברשתית בעכברים על ידי צביעה חיסונית

Summary

הפריציטים בכלי הדם ברשתית נבדקו על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם β קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם לאחר הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי. הרשתית המסומנת טופלה עוד בשיטת ניקוי הרקמות והותקנה בשלמותה להמחשת התצוגות התלת מימדיות של פריציטים המקיפים את כלי הדם ברשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

Abstract

פריציטים ברשתית חיוניים להתפתחות כלי הדם וליציבות הרשתית, וממלאים תפקיד מפתח בשמירה על שלמות כלי הדם ברשתית. כדי לספק מבט מפורט על המאפיינים המורפולוגיים של פריציטים, מחקר זה תיאר גישה חדשה המשלבת הזרקה רטרו-אורביטלית של חומר פלואורסצנטי, צביעה אימונו-פלואורסצנטית וטיפול בניקוי רקמות. ראשית, לקטין העגבניות הפלואורסצנטי הוזרק לסינוס הרטרו-אורביטלי של העכבר החי כדי לסמן את כלי הדם ברשתית. לאחר 5 דקות, העכבר הוקרב, והרשתית השלמה שלו הוסרה בזהירות מכוס הרשתית ונצבעה בצורה אימונו-פלואורסצנטית בקולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם β כדי לחשוף את הפריציטים. בנוסף, הרשתית המוכתמת טופלה במגיב לניקוי רקמות והותקנה בשלמותה על שקופית המיקרוסקופ. באמצעות גישות אלה, כלי הדם והפריציטים ברשתית נצפו בבירור ברשתית השקופה. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, השגנו הזדמנויות נוספות לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה לצורך שחזור וניתוח נוסף של המאפיינים המורפולוגיים של פריציטים לאורך עץ כלי הדם ברשתית בתצוגה תלת מימדית. מבחינה מתודולוגית, פרוטוקול זה מציע גישה יעילה להדמיית פריציטים בתוך כלי הדם ברשתית, ומספק תובנות חשובות לגבי תפקידם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד.

Introduction

פריציטים ברשתית מוטבעים בתוך קרום הבסיס לאורך הצד האבלומינלי של תאי אנדותל כלי הדם, ומציגים דפוס דמוי רשת של תהליכים קצרי טווח העטופים סביב כלי הדם ברשתית¹. מגע אינטימי זה בין פריציטים לכלי הדם ברשתית תורם לשמירה על הומאוסטזיס סביבתי ברשתית². למרות שמחקרים רבים סיפקו עדויות מורפולוגיות לפריציטים בכלי הדם ברשתית, רוב ההבנה שלנו לגבי המאפיינים המורפולוגיים של פריציטים ברשתית מגיעה מטכניקות היסטולוגיות קונבנציונליות³.

בהתאם למחקרים אלה, תכננו מחקר זה כדי להציג ביעילות פרטים מורפולוגיים יותר של פריציטים במיקרו-כלי הדם ברשתית על ידי שילוב טכניקות היסטולוגיות מסורתיות עם שיטות מדעיות מודרניות ומתקדמות. הגישה כאן משלבת שלוש טכניקות מפתח: הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי בעכברים חיים, צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם β קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGFR-β), ואסטרטגיית ניקוי רקמות מבוססת ממס. הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי הוכחה כיעילה ואמינה לתצפית על כלי הדם ברשתית של עכברים הן במסגרות in vivo והן במבחנה ^4,5. PDGFR-β משמש כסמן ביולוגי נפוץ לצביעה אימונו-פלואורסצנטית של פריציטים⁶. כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של פריציטים בתוך הרשתית העבה והשלמה, אסטרטגיית ניקוי הרקמות משפרת את השקיפות ההיסטולוגית ^2,7,8.

בעוד שכל אחת מהטכניקות הללו יושמה בנפרד במחקרי רשתית, התאימות המשולבת שלהן לחקירת פריציטים בכלי הדם ברשתית העכבר נותרה לא ודאית. מכיוון שהעובי הממוצע של רשתית העכבר הוא כ-180-220 מיקרומטר⁹, תיוג נוגדנים והדמיה קונפוקלית ברקמה עבה זו ללא פינוי טיפול גורמים לעתים קרובות לאותות רקע גבוהים, מה שמסבך את התצפית על הקשר המרחבי בין פריציטים לכלי דם¹⁰. באמצעות הגישות המתוארות כאן, אנו שואפים לספק שיטה פשוטה להדמיית פריציטים בתוך כלי הדם ברשתית בתצוגה תלת מימדית (תלת מימדית) תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. מידע תאי משופר זה מפריציטים בכלי הדם ברשתית יכול לשפר את ההבנה שלנו לגבי הומאוסטזיס סביבתי ברשתית ולהדגיש אסטרטגיות פוטנציאליות להגנה על כלי הדם, ובכך לשפר את התוצאות התפקודיות בהפרעות בכלי הדם ברשתית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בשלושה עכברים זכרים צעירים C57BL/6 (בני 8-10 שבועות, במשקל 20-25 גרם). הם שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם טמפרטורה ולחות מבוקרות ואפשרו גישה חופשית למזון ומים. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ומוקסה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית (אישור מס' 2023-03-14-04) ונערך בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון די.סי., 1996).

1. הזרקה רטרו-אורביטלית in vivo של לקטין עגבניות פלואורסצנטי

1. יש להזריק 50 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל תוך צפקי כדי להרדים את העכבר. העריכו את עומק ההרדמה על ידי הערכת היעדר תגובה לגירוי צביטה בבוהן.
2. הנח את העכבר בשכיבה הרוחבית הימנית כשראשו פונה שמאלה.
3. לחץ שתי אצבעות בעדינות על האזור הפרי-אורביטלי כדי לחשוף את עינו השמאלית של העכבר כדי לאפשר את המתן הקל ביותר של ההזרקה לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי השמאלי של החיה¹¹.
4. השתמש במזרק של 1 מ"ל המצויד במחט 27G כדי לנקב בעדינות כ-2-3 מ"מ לתוך הסינוס הוורידי המסלולי של העכבר כאשר השיפוע על המחט פונה קדימה בזווית של 45°.
5. הזרקו 0.1 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל) של לקטין עגבניות פלואורסצנטי לתוך הסינוס הוורידי האורביטלי של העכבר.

2. זלוף והוצאת עיניים

1. לאחר 5 דקות לאחר הזרקת רטרו-אורביטל, יש להזריק תמיסת טריברומו-אתנול (250 מ"ג/ק"ג) תוך צפקית כדי להרדים את העכבר לעומק. לאחר מכן, המתת חסד של החיה באמצעות אקסנגווינציה וזלוף לב. לאחר הפסקת הנשימה, פתח את חלל בית החזה בעזרת מספריים כירורגיים¹².
2. לאחר הפסקת הנשימה, פתח את חלל בית החזה בעזרת מספריים כירורגיים. עקר מכשירים כירורגיים מראש ופעל במכסה אדים. השתמש במחט 24G והכנס אותה 2 מ"מ לחדר הלב השמאלי דרך קודקוד החדר השמאלי. בצע זלוף בקצב של 3 מ"ל לדקה עם 20 מ"ל של 0.9% תמיסת מלח פיזיולוגית ואחריו 20 מ"ל של 4% פורמלדהיד במאגר פוספט 0.1 M (PB, pH 7.4).
3. הניחו את העכבר שהוקרב על צדו והסירו את העור המכסה את העיניים במספריים. גרעין את העיניים עם מספריים ומלקחיים.
4. חותכים את עצב הראייה והרקמות שמסביב, ואז מרימים את העין ומעבירים לצלחת של 12 בארות לקיבוע לאחר מכן בפורמלדהיד 4% ב-0.1 M PB למשך שעתיים.
5. הגן בהקפאה על הרקמה ב-25% סוכרוז ב-0.1 M PB (pH 7.4) ב-4 מעלות צלזיוס עד שהיא שוקעת לתחתית התמיסה.
   הערה: מכיוון שרקמת העין מתייבשת היטב בתמיסת סוכרוז, ניתן לנתק את הרשתית ביתר קלות ולחלוטין, מה שמקל על מחקרים מקיפים לאחר מכן.

3. דיסקציה של רשתית

1. העבירו את העיניים לצלחת פטרי המכילה 0.1 M PB (pH 7.4) באמצעות פיפטה מפלסטיק של פסטר.
2. חודרים את קצה הקרנית במספריים חדים, חותכים סביב הקרנית והקשתית וזורקים.
3. השתמש במלקחיים כדי להסיר את העדשה וההומור הזגוגי. לאחר מכן, משוך את הרשתית בצורת ממרכז העין בעזרת מלקחיים עדינים. שוטפים את הרשתית עם 0.1 M PB (pH 7.4) בצלחת פטרי נקייה.

4. צביעה אימונו-פלואורסצנטית וניקוי רקמות של הרשתית

1. הסר בזהירות את הרשתית בצורת ודגר אותה בתמיסת טריטון X-100 2% ב-0.1 M PB (pH 7.4) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
2. העבירו את הרשתית לתמיסת החסימה (0.1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0.2% נתרן אזיד + 10% סרום חמור רגיל) וסובבו ב-72 סל"ד על השייקר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
3. מעבירים את הרשתית לתמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של אנטי-PDGFR-β עזים (10 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר דילול (0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100 + 0.2% נתרן אזיד + 1% סרום חמור רגיל) בצינור מיקרו-צנטריפוגה וסובבו על השייקר למשך יומיים ב-4 מעלות צלזיוס.
4. שטפו את הרשתית פעמיים עם מאגר כביסה (0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100) בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שמרו אותם במאגר כביסה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על השייקר.
5. למחרת, העבירו את הרשתית לתמיסה מעורבת המכילה את הנוגדן המשני של 1 מ"ג/מ"ל של חמור נגד עזים 488 ו-0.2 ננוגרם/מ"ל גרעין פלואורסצנטי 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) בצינור מיקרוצנטריפוגה וסובבו ב-72 סל"ד על השייקר למשך 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
6. שוטפים את הרשתית בצלחת 6 בארות עם מאגר כביסה למשך שעה, פי 2, בטמפרטורת החדר. שמור את הרשתית במאגר כביסה על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בצע הדמיה וניתוח לפי שלב 5 כדי לקבל את התצוגות לפני ניקוי הרקמות.
7. העבירו את הרשתית למגיב לניקוי הרקמות וסובבו אותה בעדינות ב-60 סל"ד על השייקר למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
8. לאחר טיפול ניקוי רקמות, שטפו את הרשתית בצורת עם 0.1 M PB (pH 7.4) בצלחת פטרי נקייה.
9. בצע 4 חתכים רדיאליים המגיעים לכ -2/3 מרדיוס הרשתית בעזרת מספריים קפיציים ליצירת צורת עלי כותרת.
10. משטחים ומרכיבים את הרשתית על שקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן מסירים את כל ה-PB העודף בעזרת פיסת נייר סופגת קטנה. שמור את החלק הפנימי של הרשתית כלפי מעלה על המגלשה.
11. הקיפו את הרשתית המותקנת עם מרווח ומלאו את הרווח עם מגיב טרי לניקוי רקמות וכיסוי כיסוי.

5. הדמיה וניתוחים

1. השג את המבט החיצוני של הרשתית לפני (לאחר השלמת שלב 4.6) ואחרי טיפול ניקוי רקמות.
2. סרוק את תצוגות המונטאז' של הרשתית המסומנת באמצעות סורק פרוסות רקמה פנורמי. השתמש בעדשת 2x מטרות עם NA של 0.08.
3. צלם את התמונות בהגדלה גבוהה יותר על ידי מערכת הדמיה קונפוקלית המצוידת בעדשות המטרות הבאות: עדשת 10x עם NA של 0.40 ועדשת 40x עם NA של 0.95. הגדר את חור הסיכה הקונפוקלי ל-152 מיקרומטר (עדשת אובייקטיבית פי 10) ו-105 מיקרומטר (עדשת אובייקטיבית פי 40). הגדר את הרזולוציה המרחבית של לכידת תמונה ל-1024 x 1024 פיקסלים (עדשת אובייקט 10x) ו-640 x 640 פיקסלים (עדשת אובייקטיבית 40x).
4. צלם 50 תמונות (מחסנית Z) במסגרות של 2 מיקרומטר מהרשתית המסומנת בתווית. שלב את כל התמונות במיקוד יחיד במצב הקרנה/טופוגרפיה. להגדרה, לחץ על Set Start Focal Plane > Set End Focal Plane > Set step size > Choose Depth Pattern > Image Capture > Z series.
5. צלם תמונות באמצעות אורכי גל העירור והפליטה הבאים עבור אותות פלואורסצנטיים שונים: אותות פלואורסצנטיים ירוקים ב-499 ננומטר ו-519 ננומטר; אותות פלואורסצנטיים אדומים ב-591 ננומטר ו-618 ננומטר; ואותות פלואורסצנטיים כחולים ב-401 ננומטר ו-421 ננומטר.
6. בנה מחדש את התמונות בדוגמת המילוי התלת-ממדית על-ידי ייבוא תמונות קונפוקליות של מחסנית Z לתוכנת ניתוח על-ידי בחירה באפשרות Add New Surfaces > Choose Volume settings > Choose Source Channel > Adjust display > Adjust Surface Angle > Snapshot.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מהתצוגות החיצוניות של הרשתית השלמה, שקיפות הרקמה של הרשתית השלמה הוגדלה באמצעות טיפול ניקוי רקמות בהשוואה לזו של הרשתית ללא ניקוי רקמות (איור 1).

עבור הבדיקה ההיסטולוגית על הרשתית השלמה, כלי הדם ברשתית סומנו באדום עם לקטין עגבניות פלואורסצ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה פירטנו את התהליך הטכני להדגמת המורפולוגיה של פריציטים בכלי הדם ברשתית באמצעות הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי, בדיקה אימונו-פלואורסצנטית עם PDGFR-β וניקוי רקמות על בסיס ממס. התוצאות מראות כי טכניקות אלו תואמות מאוד להדגשת פריציטים ברשתית השלמה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm