לא פולשני-3D ויזואליזציה עם תת מיקרון החלטה שימוש Synchrotron-X-ray-טומוגרפיה

Summary

השתמשנו synchrotron רנטגן טומוגרפיה במתקן האירופי קרינה Synchrotron (ESRF) אל הלא פולשני לייצר 3D מערכי נתונים טומוגרפית עם רזולוציה פיקסל של 0.7μm. באמצעות עיבוד תוכנה נפח, זה מאפשר את שיקום מבנים פנימיים במצב הטבעי שלהם, ללא חפצים המיוצר על ידי חתך היסטולוגית.

Abstract

מעט מאוד ידוע על הארגון הפנימי של מיקרו פרוקי רגליים רבים גדלים עם הגוף מתחת מ"מ 1. הסיבות לכך הן גודל קטן לציפורן קשה אשר מקשה על שימוש בפרוטוקולים של היסטולוגיה הקלאסית. בנוסף, חתך היסטולוגית הורס את המדגם ולכן יכול שלא לשמש חומר ייחודי. לפיכך, שיטה בלתי הרסניות רצוי המאפשרת להציג בתוך דגימות קטנות ללא צורך של חתך.

השתמשנו synchrotron רנטגן טומוגרפיה במתקן האירופי קרינה Synchrotron (ESRF) ב גרנובל (צרפת) אל הלא פולשני לייצר 3D מערכי נתונים טומוגרפית עם רזולוציה פיקסל של 0.7μm. באמצעות עיבוד תוכנה נפח, זה מאפשר לנו לשחזר את הארגון הפנימי במצבו הטבעי, ללא חפצים המיוצר על ידי חתך היסטולוגית. תאריך אלה יכולים לשמש מורפולוגיה, ציוני דרך כמותית, או ויזואליזציה של סרטי אנימציה להבין את המבנה של חלקי גוף מוסתרים לעקוב מערכות איברים להשלים או רקמות באמצעות דגימות.

Protocol

בעלי חיים המשמשים במחקר זה

דוגמאות של oribatid parthenogenetic קרדית Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) נלקחו מתרבות במעבדה שלנו. תרבות גדל על הטיח של פריז / לערבב פחם (09:01) בצנצנות פלסטיק, בחושך קבוע ב 20-23 מעלות צלזיוס עם כ 90% של לחות באוויר.

לדוגמא הכנה

1. דגימות נלקחו מן התרבות, לנקות עם מברשת עדינה והושמו 06:03:01 תערובת של אתנול 80%, 35% ו פורמלדהיד חומצה אצטית 100% למשך 24 שעות.
2. לאחר מכן, דגימות היו מיובש בסדרה אתנול ציון של 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ו 100% עם 3 שינויים בריכוז כל אחד, 10 דקות בין המדרגות.
3. לבסוף, דגימות הונחו להצביע טרי אתנול 100% לילה וביקורתית מיובשים CO ₂ (עלות 020, Balzers). דגימות יבשים צורפו קצה סיכות פלסטיק (1.2 ס"מ אורך, 3.0 מ"מ קוטר).

Synchrotron רנטגן טומוגרפיה

רנטגן טומוגרפיה בוצעה על ID19 beamline (ESRF, גרנובל, צרפת, הניסוי SC-2127).

1. הדגימות רכוב בעל-המדגם מותאם למיקום מרכזי הקורה.
2. דוגמאות נמדדו עם אנרגיה של 20.5 קאב. צילומי נרשמו עם CCD מקורר (ESRF FReLoN מצלמה) עם 14-bit בטווח דינאמי, 2048 × 2048 פיקסלים גודל פיקסל אפקטיבי של 0.7 מיקרומטר. תחזיות 1500 נרשמו על סיבוב מדגם 180 ° עם זמן חשיפה של 0.35 עבור כל הקרנה. המרחק גלאי ל-המדגם היה 20 מ"מ.

באמצעות מרחק מסוים בין מדגם גלאי מאפשרת הדמיה ההפרש של חומרים עם רנטגן מקדמי הנחתה נמוך (Cloetens, et al. 1996), אשר ייצרו ניגוד מספיק בתחום ההדמיה קליטה (שם המדגם נמצא ישירות מול הגלאי ). בנושאים ביולוגיים רוב האובייקטים שלב, מורכב מחומרים עם קליטה נמוכה ו / או רק הבדלים קטנים במספר אטומי (Betz, et al. 2007). עם זאת, בשלב משופרת טומוגרפיה דורש קוהרנטיות מרחבית גבוהה של קרן רנטגן הומוגנית. לכן, קרינה synchrotron מתאים יותר מסוג אלה של מדידות מאשר מחשב שולחני סורקים.

ניתוח נתונים

1. צילומי 2D וכתוצאה מכך הפכו לנתונים 3D voxel (8-bit אפור ערכים) עם אלגוריתם back-הקרנת מסוננים (Cloetens, et al., 1997)
2. הנתונים נותחו voxel עם VGStudio תוכנה מקס 1.2.1. (כרך גרפיקה, היידלברג, גרמניה).
3. גריי ערכי מהרקע הוסרו ההיסטוגרמה להדמיה-3D.
4. מוגדרים מראש המצלמה נתיבים שימשו כדי ליצור אנימציות הסיבוב ומטוסים גזיר אנימציה.
5. נתיב המוגדרים על ידי המשתמש במצלמה נוצר לעקוב מערכת העיכול של א ' longisetosus.

Discussion

במצגת זו, התמקדנו להדמיה-3D של האנטומיה הפנימית של chelicerate מיקרו arthropod. X-ray מאפשרים מדידות synchrotron פיקסל ברזולוציה של עד 0.3μm, תלוי בגודל המדגם. הנה, הראינו נתונים עם 0.7μm פיקסל ברזולוציה. באופן כללי, synchrotron רנטגן טומוגרפיה יכולה להיות שימושית לניתוח חומרים ביולוגיים קטנים (או רקמות) עם ...