ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Summary

בסרטון הזה, אנו מראים כיצד תווית בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מנגן עם כלוריד (MnCl ₂) אשר יכול להיכנס לתאים באמצעות מתח מגודרת ערוצי סידן כאשר התאים הם פעילים ביולוגית. בנוסף, אנו מציגים את השימוש MnCl ₂ כסוכן הסלולר לעומת MRI כדי לקבוע את הכדאיות במבחנה של hESC.

Abstract

בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הדגימו את היכולת לשקם את שריר הלב הפגוע. דימות תהודה מגנטית (MRI) התפתחה כאחד שיטות הדמיה משתלט על מנת להעריך את שיקום שריר הלב הפגוע. יתר על כן, לשעבר vivo סוכנים תיוג, כגון תחמוצת ברזל חלקיקים, להיות מועסק לעקוב בתרגום בתאי גזע המושתלים. עם זאת, שיטה זו אינה לפקח על נכס מהותי ביולוגיה תאית לגבי הכדאיות של התאים המושתלים. זה כבר ידוע כי כלוריד ומגנזיום (MnCl ₂₎ נכנס לתאים באמצעות סידן מתח מגודרת (Ca ^{2 +)} תעלות כאשר התאים הם פעילים ביולוגית, ומצטברים intracellularly לייצר T ¹ אפקט התקצרות. לכן, אנו ממליצים מנגן מונחה MRI יכול להיות שימושי כדי לפקח על כדאיות התא לאחר ההשתלה של hESC לתוך שריר הלב.

בסרטון הזה, אנו מראים כיצד תווית hESC עם MnCl ₂ ואיך תאים אלה ניתן לראות בבירור באמצעות MRI במבחנה. במקביל, הפעילות הביולוגית של Ca ^{2 +} ערוצים תהיה מווסתת ניצול הן Ca ^{2 +} ערוץ אגוניסט אנטגוניסט וגם כדי להעריך את השינויים אותות במקביל.

Protocol

תיוג מנגן של בתאי גזע עובריים אנושיים

1. Trypsinize נובעת עובריים אנושיים אשר היו בתרבית מזין ללא תנאי למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת אמצעי התקשורת והתרבות.
2. ספין את התאים על ידי centrifuging בסל"ד 800 במשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מחדש השעיית תא גלולה, לספור את מספר התאים על ידי מכתים trypan כחול. בהתבסס על ספירת התאים המתקבלים, לחלק את התאים לארבע aliquots של 3 מיליון תאים לתוך צינורות חרוטי. גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה.
3. בדיוק לפני תחילת תיוג מנגן, מנגן כלורי מתמוססים טרי עם פתרון 0.9% נתרן כלוריד לעשות פתרון 0.1mm כלוריד ומגנזיום.
4. על מנת לצפות בערוץ פעילות סידן, ארבע דגימות היו מוכנים. הדוגמה הראשונה היא השליטה שלנו המכיל תאים מודגרות ב 0.9% נתרן כלוריד לבד. המדגם השני מכיל תאים מודגרות מ"מ 0.1 MnCl _2. לדוגמה 3 ו 4 מכילים תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl עם ₂ או 5 מיקרומטר של Ca ^{2 +} ערוץ אגוניסט, (ים )-(-)- מפרץ K8644, או 250 מיקרומטר של Ca ^2, ערוץ ⁺ אנטגוניסט verapamil. דגירה ארבע דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ למשך 30 דקות.
5. לאחר 30 דקות, לסובב את התאים ב 800 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. ואז לשאוב supernatant לשטוף את התאים שכותרתו פעמיים עם PBS. לאחר כביסה, מחדש להשעות כל גלולה עם 200 PBS μL ולהעביר לתוך צינורות PCR. כדורי אלה הם בדרך כלל לבן.

הברזל תיוג של בתאי גזע עובריים אנושיים

1. מערבבים קליני כיתה סולפט protamine עם מים מזוקקים כדי לקבל 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות.
2. בתוך שפופרת המכילה אדם בתאי גזע עובריים מדיה, תרבות, להוסיף ferumoxides על 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ואחריו תוספת של 12 מיקרוגרם / סולפט protamine מ"ל. מערבבים את הפתרון נמרצות במשך חמש דקות.
3. הוסף פתרון מעורב לסכום השווה של התקשורת בתרבות התא כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ferumoxides ו 6 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סולפט protamine לתאי התווית. דגירה תאים בפתרון זה למשך 12 שעות.
4. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, עם לשטוף האחרון המכילה הפרין 10U/ml לפזר את מורכבות תאי ferumoxides-protamine סולפט. לאחר כביסה, trypsinize תאים כדי לקבל השעיה תא בודד.
5. ספירת התאים aliquot למספר הנדרש של דגימות. לאחר כביסה, מחדש להשעות כל גלולה עם 200 PBS μL ולהעביר לתוך צינורות PCR. כדורי אלה צריכים להיות כתום כהה בצבע חום.

ביצוע תהודה מגנטית נייד

1. הפוך רפאים כדי לייצב את צינורות המכילים את כדורי תא וגם כדי למנוע חפצים מהאוויר שמסביב במהלך סריקה. כדי לעשות זאת, תערובת של אגר 0.8% ו -1% של נחושת גופרתית במים מזוקקים ולהביא לרתיחה על ידי במיקרוגל במשך 5-7 דקות. מצננים את התערובת למשך שעה לפחות לפני 1 של סריקה להשיג ג'ל.
2. צינורות המכילים את כדורי תא שכותרתו ממוקמים הפנטום לסריקה. במבחנה הסלולר MRI מבוצעת Signa HDX 3T MRI (GE Medical Systems) באמצעות סליל הברך קליניים.
3. סרוק את התאים שכותרתו מנגן על כל אחד משלושת הדגימות באמצעות הד ספין רצף: TR: זמן החזרה = 800 msec. TE; זמן אקו = מינימום, FOV, שדה הראיה = 12 x 12 ס"מ; מטריצה ​​= 256x256, NEX 1.
4. סרוק את התאים ברזל שכותרתו באמצעות רצף הדרגתי-echo. אנו משתמשים בפרמטרים הבאים עבור הדמיה זו: TR = 100 msec; TE = 10 msec, FA, זווית להעיף = 30 °; FOV = 12 x 12 ס"מ; מטריצה ​​= 256 x 256, NEX 1.

ניתוח תוצאות ה-MRI

1. ניתוח תמונות של MRI בסריקה מתוך 4 מדגמים שונים של תאים מנגן שכותרתו:
   • דוגמה מס '1 היא השליטה שלנו המכיל תאים מודגרות ב 0.9% נתרן כלוריד לבד.
   • דוגמה מס '2 מכיל תאים מודגרות מ"מ 0.1 MnCl _2.
   • לדוגמא # 3 מכיל תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl ₂ עם 5 מיקרומטר של Ca ^{2 +} ערוץ אגוניסט, (ים )-(-)- מפרץ K8644.
   • לדוגמא # 4 מכיל תאים מודגרות ב 0.1 מ"מ MnCl ₂ עם 250 מיקרומטר של Ca ^2, ערוץ ⁺ אנטגוניסט verapamil.
2. כצפוי, ההבדלים בעוצמות אות מתאי שכותרתו מנגן גלויים. בהשוואה לתאי שכותרתו טהורה עם מנגן, את עוצמת האות בצורה ברורה עליות בנוכחות אגוניסט ערוץ הסידן פוחתת בנוכחות של אנטגוניסט תעלות סידן. האזור שבו עוצמת האות גדלה עבור תאים שכותרתו מנגן נמדדים באמצעות תמונה J (NIH, Bethesda, MD, ארצות הברית). התוכנה אותה משמש לניתוח שטח של האות מחוץ תהודה כהה מתאי שכותרתו ברזל. גודל האות האפל של ברזל שכותרתו התאים תלוי במספר התאים או את מספר חלקיקי ברזל הכיל ידי התאים. במקרה זה, 1,000,000 תאים מראה שטח קטן יותר של האות האפל לעומת האות מ 3,000,000 תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תוצאות אלו מצביעות כי אינו מנגן להיכנס דרך ערוץ מתח מגודרת סידן, מנגן יכול לשמש חומר ניגוד MRI, אשר יכול גם להציג את כדאיות התא. לכן, אנו ממליצים מנגן מונחה MRI יכול להיות שימושי כדי לפקח על כדאיות התא לאחר ההשתלה של בתאי גזע עובריים אנושיים לתוך שריר הלב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190