Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי

Summary

שיטה פשוטה ספציפי הודגם תיוג פלורסנט וזיהוי מוגברת של חלבונים פני התא ללא צעד חלוקה. שפע דיפרנציאלי חלבונים פני התא נותח באמצעות אלקטרופורזה דו מימדי (2-D) ו Ettan טכנולוגיית ™ DIGE.

Abstract

חלבונים Surface הם מרכזי ביכולתו של התא להגיב על סביבתו כדי אינטראקציה עם תאים שכנים. הם ידועים להיות מעוררים כל איתות של כמעט תאיים. יתרה מזאת, הם ממלאים תפקיד חשוב בהתאמת הסביבה טיפול תרופתי, לעתים קרובות מעורבים בהיווצרות המחלה והפתולוגיה (1). חלבונים הם אינטראקציות מהותי מסלולי איתות, ולקבל תובנה יותר אלה תהליכים ביולוגיים מורכבים, שיטות רגיש ואמין יש צורך ללמוד משטח חלבונים בתא. דו מימדי (2-D) אלקטרופורזה נעשה שימוש נרחב לגילוי של סמנים ביולוגיים ויעדים אחרים בדגימות חלבון מורכב ללמוד שינויים ההפרש. שטח פני התא חלבונים, בין היתר בשל שפע הנמוכה שלהם (1 ​​2% של חלבונים תאיים), קשה לזהות בתוך ג'ל 2-D ללא חלוקה או סוג אחר של העשרה. לעתים קרובות הם גם ייצגו גרוע 2-D ג'לים בשל אופי הידרופובי שלהם משקל מולקולרי גבוה (2). במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש של תאים שלמים באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי עבור תיוג זיהוי ספציפי של קבוצה חשובה זו של חלבונים. התוצאות הראו תיוג ספציפית של מספר רב של חלבונים פני התא עם תיוג מינימלי של חלבונים תאיים. פרוטוקול זה הוא מהיר, פשוט לשימוש, וכל שלושת CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי (סי 2, סי 3 וסי 5) ניתן להשתמש בתווית על פני קרום התא חלבונים. תכונות אלו מאפשרות ריבוב באמצעות 2-D ההבדל Fluorescence ג'ל אלקטרופורזה (2-D DIGE) עם טכנולוגיית DIGE Ettan וניתוח של שינויים בביטוי החלבונים באמצעות DeCyder 2-D ניתוח תוכנה דיפרנציאלי. רמת פני קרום התא חלבונים לוותה במהלך רעב סרום של תאים CHO עבור אורכי זמן שונים (ראה טבלה 1). שינויים קטנים שפע התגלו עם דיוק גבוה, והתוצאות נתמכים על ידי שיטות סטטיסטיות מוגדר.

Protocol

תא תרבות

1. לגדל אוגר סיני השחלות תאים (CHO-K1) באמצעות תקן תרבות נהלים תא בינוני F-12 חם עם GlutaMAX אני המכילה 10% נסיוב עגל עוברית, 50 U / ml פניצילין, ו -50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין סולפט (Invitrogen).
2. הבורסה בינוני תרבות סרום ללא התקשורת. התא תווית חלבונים פני השטח היו בנקודות זמן שונות עם CyDye DIGE פלואוריד Cy3 או Cy5 צבעים מינימלי (ראה סעיף Cell Surface תיוג, להלן).
3. בריכת מספר שווה של התאים מנקודת כל הזמן עם תווית CyDye DIGE פלואוריד Cy2. השתמש אלה כסטנדרט פנימי עבור ג'ל 2-D כל אחד.
4. רוב הניסויים ניתן לבצע עם CHO-K1 תאים, אבל העובר עכבר fibroblasts (L1 3T3) ו מיימת עכבר לימפומה lymphoblasts (EL4) יכול גם בשימוש (מידע לא מוצג).
5. לגדל את שני סוגי התאים האחרונים ב DMEM בינוני עם GlutaMAX השנייה, אבל, אחרת, השתמש התנאים זהים המשמשים את CHO-K1 תאים.

משטח נייד תיוג

1. בזהירות לנתק תאים חסיד שאינו enzymatically, לספור חלוקת לתוך aliquots של x106 תאים 5-10. עבור תאים הגדלים ההשעיה, להשמיט את הצעד ניתוק.
2. צנטריפוגה השעיות התא XG על 800 במשך 5 דקות. הסר את supernatants המכיל את המדיום.
3. לשטוף את כדורי ידי resuspendion בתוך תמיסת מלח מאוזן 1 מ"ל קרח קר של האנק (HBSS) pH 8.5. Centrifuged ב XG 800 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
4. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 200 μl חיץ תיוג קרים כקרח (HBSS pH 8.5, 1 M אוריאה).
5. לייבל בתאים שלמים עם 600 pmol CyDye צבעים DIGE פלואוריד מינימלית במשך 20 דקות על הקרח בחושך.
6. להרוות את התגובה על ידי הוספת 20 μl 10 mM ליזין. דגירה במשך 10 דקות.
7. שטפו את פני השטח שכותרתו תאים פעמיים resuspension ב-pH 500 HBSS μl 7.4, ואחריו צנטריפוגה ב XG 800 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.

Cell ו תמוגה חלוקה

1. Lyse את פני השטח שכותרתו תאים חיץ תמוגה μl 150 קרים (7 אוריאה M, 2 M thiourea, בחורים 4%, 30 מ"מ טריס, 5 mM מגנזיום אצטט pH 8.5). השאירו על הקרח עבור שעות לפחות 1 עם vortexing מזדמנים.
2. צנטריפוגה lysates XG ב 000 10 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מעבירים את supernatant לצינור חדש. מדגם זה הוא מדגם שאינם מופרדים המכיל את כל חלבוני התא.
3. במקביל, לשטוף כדורי התא, כאמור לעיל, fractionate אז (באמצעות ערכת חלוקה קרום, פירס) לתוך הממברנה שברים cytosolic לפני ג'ל אלקטרופורזה 2-D. חלק הממברנה מכילה פנימיים קרום התא חלבונים השטח.
4. לשם השוואה, בצע את ההליך הסטנדרטי Ettan DIGE ^3, lyse, התווית, ולבסוף, fractionate התאים. קביעת ריכוז חלבון בדגימות באמצעות 2 - ד קוואנט Kit (GE Healthcare).

2-D אלקטרופורזה

1. רעננותם ג'לים Immobiline DryStrip, pH 3-11NL (24 ס"מ) באמצעות מגש DryStrip Immobiline Reswelling, 24 ס"מ 450 פתרון DeStreak μl Rehydration (0.5% IPG Buffer) לילה.
2. החל את CyDye שכותרתו דגימות (המקביל ל 50 מיקרוגרם חלבון בסה"כ) כדי Immobiline ג'לים DryStrip ידי טעינת כוס anodic ב סעפת ולבצע התמקדות isoelectric (IEF) באמצעות Ettan IPGphor מערכת II IEF על פי ההוראות.
3. לאחר IEF, לאזן את רצועות בשני שלבים ומקום על גבי (26 x 20 ס"מ) ג'לים גדול polyacrylamide 12.5% ​​(SDS-PAGE). שכבת עם agarose 0.5% (בניהול מאגר המכיל כחול bromophenol). Run 2-D באמצעות אלקטרופורזה Ettan מערכת DALTtwelve אנכי גדול ב 5 W / ג'ל למשך 30 דקות ולאחר מכן ב 15 W / ג'ל עד בחזית לצבוע מגיע לתחתית הג'ל.

הדמיה וניתוח נתונים

1. לאחר השלמת 2-D אלקטרופורזה, לסרוק את הג'לים עבור Cy2, Cy3 או Cy5 באמצעות Imager טייפון 9410 מצב משתנה.
2. השווה מפות במקום שברים של הממברנה, שברים cytosolic, שאינם מופרדים באמצעות דגימות DeCyder 2-D ניתוח דיפרנציאלי תוכנה ^4.

פוסט מכתים

1. לאחר הדמיה, כסף הכתם ג'ל על פי הנוהל המקובל ^5.

חלבון זיהוי

1. לגדול, קציר, לרחוץ lyse כמויות preparative (כ 1 מ"ג חלבון הכולל 10 x106 בתאי CHO) של תאים, כפי שתואר לעיל למדגם הלא מופרדים. השתמש Cy5 פני התא מדגם שכותרתו (ראה לעיל) כמו ספייק, ולהחיל יחד עם כמויות תווית preparative של חלבון.
2. ביצוע אלקטרופורזה 2-D כפי שתואר לעיל, אך הפעם, aplly תא 600 מיקרוגרם ללא תווית lysate יחד עם משטח 50 מיקרוגרם תא שכותרתו ספייק ידי יישום כוס anodic. השתמש בסמנים כדי לאפשר התייחסות לקטוף במקום הנכון, במקום להיותtween הזכוכית צלחות לפני יציקת ג'ל על פי המלצות ^3.
3. סרוק את הג'ל בערוץ Cy5 כדי לקבל את פני התא Cy5 נקודה במפה, ואחריו מכתים חלבון סך הכל באמצעות חלבון סגול עמוק כתם ^3.
4. התאמה יחד את שתי מפות נקודה באמצעות DeCyder 2-D התוכנה ליצור רשימה לבחור עבור כל המקומות המתאימים 5 סיי חלבונים השטח שכותרתו התא. פיק פני התא חלבונים באמצעות נקודה Ettan תחנת הטיפול, לחלץ את המצתים ג'ל, ו trypsinate באמצעות digester Ettan. זיהוי באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה.

טבלה 1. DIGE Ettan הניסוי בוצע באמצעות דגימות מתאי מדולדל בסרום סומנו על פי הפרוטוקול על פני קרום התא חלבון תיוג באיור 1.

מדגם	זמן של דלדול בסרום	מדביקים לו תווית עם CyDye	ג'ל מספר
1	-	סי 3, סי 2	1
2	30 דקות	סי 5, סי 2	1
3	2 שעות	סי 3, סי 2	2
4	4 שעות	סי 5, סי 2	2
5	16 שעות	סי 5, סי 2	3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ריכוז חלבון

סקירה של שני workflows תיוג מוצג באיור 1. מאז התאים הם עדיין שלם שכותרתו כאשר על פי פרוטוקול פני קרום התא תיוג חלבון, רק פני חלבונים בתא נחשפים לצבוע. ב תקן Ettan DIGE פרוטוקול, התאים lysed לפני תיוג חלבונים בתוך כמו גם מחוץ לתא מסומנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122