מודל hypoxic אנצפלופתיה איסכמי של איסכמיה הלידה

Summary

המודל עכברוש הלידה לפגיעה hypoxic-איסכמי המוח הוא מודל ומבוססת של אנצפלופתיה הילוד האנושי איסכמי היפוקסי (HIE). במאמר זה, אנו מתארים את המודל של HIE ב שלאחר הלידה גורי חולדה.

Abstract

Hypoxic-איסכמי אנצפלופתיה (HIE) הוא תוצאה של חנק מערכתית המתרחשים בלידה. עשרים וחמישה אחוזים של יילודים עם HIE לפתח sequelae neuropsychological חמור וקבוע, כולל פיגור שכלי, שיתוק מוחין ואפילפסיה. התוצאות הן הרסניות של HIE וקבוע, מה שהופך אותו קריטי לזהות ולפתח אסטרטגיות טיפוליות כדי להפחית פגיעה מוחית בתינוקות עם HIE. לשם כך, המודל עכברוש בילוד לפגיעה hypoxic-איסכמי במוח פותחה מודל זה המצב האנושי. המודל HIE היה תוקף לראשונה על ידי ואנוצ'י ואח' ¹ ומאז נעשה שימוש נרחב כדי לזהות את המנגנונים של פגיעה מוחית כתוצאה הלידה היפוקסיה ^{איסכמיה-2} ו לבדוק התערבויות טיפוליות פוטנציאל ^3,4. המודל HIE הוא תהליך דו שלב כרוך קשירת של עורק התרדמה השמאלי משותף ואחריו חשיפה לסביבה hypoxic. זרימת הדם במוח (CBF) בחצי הכדור ipsilateral על עורק הצוואר ligated אינו פוחת בגלל זרימת דם בטחונות דרך המעגל של ויליס, אולם עם מתח חמצן נמוך, CBF בחצי הכדור ipsilateral מקטין באופן משמעותי ותוצאות פגיעה איסכמי חד צדדית . השימוש כלוריד-2,3,5 triphenyltetrazolium (TTC) להכתים ולזהות רקמת מוח איסכמי פותחה במקור עבור דגמים הבוגרת של איסכמיה מכרסם מוחין ^5, והוא משמש כדי להעריך את מידת infarctin מוחין בנקודות זמן מוקדם של עד 72 שעות לאחר האירוע איסכמי ^6. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את המודל hypoxic-איסכמי פגיעה במוח חולדה הלידה ואת הערכה של גודל האוטם באמצעות מכתים TTC.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש באוניברסיטת סטנפורד פועלת לפי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות מעבדה.

עכברוש ילודים HIE מודל

1. יום הודעה הלידה (PND) 7 Sprague-Dawley גורי חולדה (Charles River Laboratories, Inc, בווילמינגטון, MA) מורדמים באופן מלא עם isoflurane (Aerrane, בקסטר, Deerfield, IL;% 3-4 לזירוז ו 1-2% עבור תחזוקה).
2. חתך קטן עשה בצוואר (Extra Thin איריס מספריים # 14088-10, פיין למדע כלי Inc, פוסטר סיטי, קליפורניה) כדי לחשוף את עורק התרדמה השמאלי משותף (CCA).
3. המרכז לאמנות עכשווית הוא ligated עם תפר 5-0 משי (5-0 משי, Ethicon, סומר, NJ).
4. החתך נסגר עם דבק cyanoacrylate (Elmers מוצרים Inc, קולומבוס, OH). החתך מכוסה קלטת הרדמה היא נעצרה. הגורים הם חזרו אל הסכר שלהם מותר להתאושש במשך 1-2 שעות.
5. גורים ממוקמות אז בתא hypoxic המכיל חמצן 8% מאוזנת עם חנקן 92% עבור 100 דקות 37 ° C. 8 oxygen/92%% גז חנקן (Airgas, סקרמנטו, קליפורניה) זרימה דרך צינור לתוך הכלוב העכבר מצויד בכיסוי פלסטיק. הכיסוי עשוי להתאים לכלוב ויש לו שני חורים של 2 ס"מ קוטר, אחד מהם לקבל את הצינור המחובר הטנק 8% חמצן גז אחר מאפשר הגז flowout. החדר ממוקם בתוך אמבט מים הוא התחמם לפני השימוש מדחום בתוכו חייב לרשום 37 ° C לפני תחילת היפוקסיה.
6. בתום 100 דקות של היפוקסיה, הגורים הם חזרו שוב אל סכר שלהם להחלמה.
7. 24 שעות לאחר סיומה של היפוקסיה, הגורים מומתים על ידי הרדמה עמוקה עם isoflurane. רקמת המוח היא perfused עם מלח רגיל קר, ואחריו פתרון של TTC 1% קר פוספט pH שנאגרו מלוחים, 7.4 (Sigma כימית Co, סנט לואיס, מיזורי). TTC חייב להישמר מפני אור.
8. המוח יוסרו מקורר למשך 1-2 דקות על קרח, לארבעה חלקים העטרה 3 מ"מ זה מזה (רמות 1-4) נחתכים, החל rostrally ברמה של opticchiasm ו משפך, המתאים גבחת 1.8 ~ 2.0 מ"מ רמת המוח עכבר מבוגר.
9. פרוסות המוח שקועים פתרון TTC וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות, ואחריו קיבעון paraformaldehyde 4% / PBS לילה. מכיוון TTC אור רגישים, לשמור על פרוסות מן האור בתקופה זו.
10. סעיפים מוכתם TTC נסרקים ו דיגיטציה. באמצעות תמונה J (NIH, Bethesda, MD), את הדברים הבאים נמדדים עבור כל רמה: אזור של אוטם (אזור בלא כתם), שטח של חצי הכדור ipsilateral, ועל שטח של חצי הכדור הנגדי. אחוז infarcted שטח לכל פרוסה מחושב: (באזור של האוטם / שטח של חצי הכדור ipsilateral) או _{1, 2, 3, 4.} נפח אחוז האוטם מחושב כסכום ₍₁ + ₂ + ₃ + ₄₎ * 3mm. תחומי פגיעה בקליפת המוח או striatal ניתן לכמת בנפרד באופן דומה.

נציג תוצאות

באיור 1. נציג HIE העטרה רמות 1-4 מוכתם TTC.

סעיפים TTC העטרה מוכתם להפגין שטח של האוטם (בלבן).

Discussion

המודל הלידה מכרסם HIE הוא מודל נקבע כי משחזר היפוקסיה מוחית המתרחשים בתקופה פרי הלידה של ילודים. מחקרים נרחבים אפיון היסטולוגית ו immunocytochemical הראו כי מכרסמים בן 7 היום יש את הבגרות המוח מקביל מודל בשליש השלישי העובר האנושי ^7. המודל HIE מכרסם כבר אינפורמטיבי מאוד להבנת המנגנונים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley Rat Pups	Animal	Charles River Laboratories
Isoflurane	Surgery	Baxter Internationl Inc.
8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas	Surgery	Airgas
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	T8877
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Reagent	GIBCO, by Life Technologies
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148