נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של מחקר כדי למנוע עיוורון, NIH מענק EY 019312, ולהעניק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון ו EY 02,687 (מחלקת עיניים &amp; חזותית למדעים באוניברסיטת וושינגטון).

ביצוע אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את האלקטרודות הקלטה באמצעות חולץ micropipette וללטש את האלקטרודות עם נימה חימום תחת מיקרוסקופ. להקלטת עכבר תא בודד חרוט יניקה, הקוטר הפנימי על קצה האלקטרודה הוא כ 6-7 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות התייחסות. לשקול אגר 1% מים מזוקקים. ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו את pipettes זכוכית (L = 100 מ&quot;מ, OD / ID = 1/0.75 מ&quot;מ) עם אגר 1% באמצעות מזרק. לחזק את אגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את pipettes לחצאים באמצעות סכין יהלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את האלקטרודות בתמיסה התייחסות התייחסות לפחות 24 שעות 4 ° C. </li></ol> הגדרת הניסוי <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dark להסתגל עכבר בכלוב שחור לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל התייחסות פתרון 1 זלוף L פתרון (ראה להלן) ולסנן את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים BSA 0.1% ו 10 מ&quot;מ פתרון גלוקוז 20 מ&quot;ל התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את עוצמת האור של ממריץ האופטי באמצעות פוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרית הקלטה על הבמה של המיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה זלוף פתרון עם 95% O 2 / 5% CO 2, דגירה אותו באמבט 40 מעלות צלזיוס מים כדי להגדיל את מסיסות של CO2. הפתרון זורם מהבקבוק לתא הקלטה עובר דרך הנגד קרמיקה ההתחממות אותה 36-38 ° C. החימום צריך להיות ממוקם קרוב לתא הקלטה ככל האפשר, רצוי בשלב של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את ווסת הזרימה עבור קצב זרימה של כ 1-1.5 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את האלקטרודה פתרון ההקלטה עם הפניה. הכנס את אלקטרודה בעל אלקטרודה. ודא שאין בועות האלקטרודה. הר בעל על headstage של המגבר. חבר את מחזיק למכשיר שאיבה, אשר בנויה על ידי חיבור צינורות מלא חלקית עם שמן מינרלי לנמל בצד של בעל אלקטרודה. בקצה השני של הצינור מחובר מאגר קטן של שמן מינרלי, שבה הלחץ יכול להיות מיושם על ידי הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה התייחסות הקוטב השני של headstage. Bind הזוג תרמית (TC) אל האלקטרודה התייחסות. ודא טיפים אלקטרודה TC הם קרובים זה לזה, כך הקריאה הטמפרטורה נלקח קרוב לתא האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תאורה אינפרא אדום כדי להמחיש את האלקטרודה. אלקטרודה היא נצפים על ידי מצלמת אינפרא אדום המחובר לצג. במרכז התמונה אלקטרודה על שדה הראייה של המסך באמצעות מניפולטור מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקום של קרוב אלקטרודה קצה הפניה (2-4 מ&quot;מ) אל קצה האלקטרודה ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח DC עבור החימום כך את הטמפרטורה של הפתרון הוא על 36-38 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל בדיקה חותם כדי לבדוק את ההתנגדות של האלקטרודה הקלטה, בדרך כלל על 900 kΩ. </li></ol> בידוד הרשתית העכבר <ol start="18" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אור אדום עמום, להרדים את העכבר מותאם כהה עם CO 2 ו נקע בצוואר הרחם. סמן את העיניים בעזרת קצה של לפיד מתכת לוהטת על ידי צריבה נקודת הגב רוב בלובן העין מעט. Enucleate את העיניים בעזרת מספריים. כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת אור אינפרא אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect את העיניים תחת מיקרוסקופ עם תאורה אינפרא אדום וממירים התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרנית ואת העדשה. הסר כמה שיותר הזגוגית האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקליט M-חרוט התגובות, להסיר את החלק הגחוני של עיינית 4 בסכין גילוח אם לשפוט על פי סימן כויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל הרשתית מהשכבה אפיתל הפיגמנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטחו את הרשתית ולשים אותו על החלק התחתון של צלחת פטרי מלאות פתרון מ&quot;ל 1-2 התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את הרשתית לחתיכות קטנות דק בעזרת סכין גילוח ו דגירה הכנת בתיבה אור חזק רווי חמצן טהור. </li></ol> הקלטות <ol start="25" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבו את התנור באופן זמני. החלף את זרימת זלוף אל צינור עוקף כדי למנוע את תא מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את רוב הפתרון בחדר באמצעות פיסת רקמה Kimwipe. מעבירים את ההשעיה הרשתית לתא הקלטה בעזרת פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כ -2 דקות עד פרוסות הרשתית להתיישב. כבה את זלוף בחזרה. הפעל את החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תאורה אינפרא אדום כדי להמחיש את ההכנה. חיפוש עבור פיסת של הרשתית שוכב על החדר עם פלחי photoreceptor החיצוני בולטות (ראה איור למשל). צייר חלקים פנימיים בעדינות לתוך האלקטרודה על ידי יניקה. בתצורה זו, כמה גרעינים וקטעי הפנימי צריך להיגרר האלקטרודה. הקלט את photoresponse להבהב בהיר כדי לבדוק אם קטע חרוט הפנימי הוא האלקטרודה והאם התא לרפאכמוך, אם לשפוט לפי התגובה קינטיקה משרעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את מאגר המינרלים להפעיל לחץ שלילי קל עד קצה האלקטרודה כדי לעזור להחזיק את פלח הפנימית האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן פלאש שיא ותגובות עמום לעוצמת בהיר פעם תא טוב נמצא. גלי מבחן ניתנים מתוך גירוי אופטי מכויל 5. עוצמת פלאש הגל נשלטים על ידי מערכת של מסנני צפיפות ניטרלי וצר התערבות מסננים הלהקה, בהתאמה. מבחן משך פלאש (20 מילישניות) נשלטת על ידי מחשב מונחה התריסים. </li></ol> פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף פתרון עכבר: 112.5 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinate, 0.5 mM Na גלוטמט, 0.02 mM EDTA, ו 10 mM גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטה עכבר פתרון אלקטרודה: 140 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 3 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4), 0.02 mM EDTA. </li></ol>

<ol>
	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+of+Nrl+-/-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms.">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation.">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li></ol>

תא בודד הקלטה יניקה מן התאים קולטי האור פותחה 3 עשורים. זה מאפשר לנו להקליט קרום טרנס השינוי הנוכחי המושרה על ידי גירוי האור מבלי לחדור קרום התא. בגלל הידבקות תאים תאים גבוהה, קשה לבודד את מוט יחיד חרוט בריא מן הרשתית כמו עכבר הרשתית דוחי וקשה למצוא קונוסים בודדים בשל א...

single-cell suction recordings from mouse cone photoreceptors

רוד חרוט קולטני האור ברשתית אחראים לגילוי האור. בחושך, מחזורית נוקלאוטיד-מגודרת (CNG) ערוצי בקטע החיצוני פתוחים ולאפשר קטיונים לזרום פנימה בהדרגה על פני קרום, depolarizing התא. חשיפה לאור מעורר את סגירת הערוצים CNG, חוסם את זרימת קטיון פנימה הנוכחי, ולכן התוצאות hyperpolarization התא. בהתבסס על הקוטביות של קולטני האור, שיטת ההקלטה יניקה פותחה בשנות ה -1970, שבניגוד טכניקת התיקון-clamp קלאסי, אינו מחייב לחדור הממברנה הפלסמטית<sup&gt; 1</sup&gt;. ציור קטע החיצוני לתוך פיפטה כוס בחוזקה, הולם מלאים פתרון תאיים מאפשר הקלטה השינויים הנוכחית תאים בודדים בחשיפה מבחן פלאש. עם זאת, ומבוססת &quot;החיצוני פלח-in (OS-in)&quot; הקלטה יניקה אינו מתאים הקלטות חרוט העכבר, בגלל האחוז הנמוך של חרוטים ברשתית העכבר (3%) ואת הקשיים בזיהוי חרוט החיצוני מגזרים. לאחרונה, קטע הפנימית ב-(IS-in) הקלטה תצורה פותחה כדי לצייר את המקטע הפנימי / אזור הגרעין של photoreceptor לתוך פיפטה הקלטה<sup&gt; 2,3</sup&gt;. בסרטון הזה, אנו מראים כיצד להקליט מאדם חרוט photoresponses עכבר באמצעות תא יחיד אלקטרודה יניקה.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors at JoVE.com

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

אנחנו נראה איך להקליט תגובות פלאש מן קונוסים עכבר בודד באמצעות אלקטרודה יניקה.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Washington University in St. Louis, School of Medicine. אנחנו נראה איך להקליט תגובות פלאש מן קונוסים עכבר בודד באמצעות אלקטרודה יניקה.

Video: Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...