עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן הלאומית למדע (CBET 0,846,453).

1. המצאה של אדונים סיליקון באמצעות photolithography סטנדרטי SU-8 1 (לא רואים בסרט הזה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקן SU-8 שיטות photolithography ליצור SU-8 &quot;אמן&quot; (SU-8 2025, MicroChem, ניוטון, MA) בודה את התבנית PDMS המכיל את רשת microfluidic קאמרית chemotaxis. תבניות הורים כאלה יכולים להיות מפוברק בכל מתקן microfabrication (למשל, סטנפורד מיקרופלואידיקה יציקה; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שכפול PDMS, לחשוף את SU-8 המאסטר אדי fluorosilane בתוך תא ייבוש המחובר למקור ואקום כדי להקל על שחרור קל של PDMS מן האדון. הוסף ירידה של fluorosilane על מגבת נייר וליישם ואקום דקות אחד. הסר את האבק ולאפשר 30 דקות עבור בתצהיר של fluorosilane. שמור את המאסטר SU-8 בכלי סגור לשימוש עתידי. </li></ol> 2. דפוס Replica של PDMS ממורה SU-8: שכבת fluidic ואת השכבה מלאה מיוצרים על ידי דפוס העתק של PDMS ממורה SU-8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את PDMS מראש פולימר צולבות מקשר ב wt 10:01. יחס דגה ב dessicator במשך שעה 1 (או עד בועות אוויר יוסרו מן התערובת PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המאסטר SU-8 בצלחת פטרי ובזהירות לשפוך את התערובת PDMS על גבי יחידת SU-8 בעובי הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את צלחת פטרי שמכילה את PDMS ואת SU-8 עובש אמן 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לרפא את PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נרפא PDMS מכוסה SU-8 הורים מתוך פלטה חשמלית לבין קליפת עובש PDMS מן האב SU-8. המבנה הרצוי יהיה מוטבע עובש PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קודח חורים עובש PDMS עבור צינורות אל הגנרטור שיפוע כניסת התא באמצעות 20 מד בוטה לקצה המחט. </li></ol> 3. Bonding PDMS של מכשירים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה מיקרוסקופ זכוכית שקופית עם isopropanol ויבש עם חנקן או זרם אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את PDMS והחלק הזכוכית פלזמה חמצן אשר פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מביאים את התבנית PDMS במגע עם שקופיות הזכוכית. מחממים את השקופית קשר עם עובש PDMS עד 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li></ol> 4. הרכבת המכשיר PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, לחתוך צינורות ב 45 ° זווית באורך הנכון הנדרש עבור המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה אחד של הצינור לתוך החורים אגרוף המכשיר (למשל, שקע) באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להכניס מחט קהה 30-מד אל הקצה השני של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 עבור כל החורים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 1mL של chemotaxis חיץ (CB) בתוך מזרק 3mL, מקפיד להסיר בועות אוויר מן המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רכזת המחט בקצה אחד של הצינור לשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CB לרכזת את המחט, והקש הרכזת מחט כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלחצי קצת לא CB של קצה המזרק וחבר את המזרק 3mL לרכזת את המחט ללא השמנה האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Push CB דרך המכשיר עד שכל רכזות מחט הנותרים מלאים עם CB. זה אמור להסיר את רוב בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי שני מזרקים 500μL עם CB המכיל ריכוזי המתאימה של chemoeffector נבדק. מנע היווצרות בועת אוויר על ידי לחיצה על ירידה קטנה של תכולת המזרק נוגע טיפה לנוזל ב לרכזת את המחט מצרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, לחבר מזרק המכיל CB אל כניסת חיידקים. זו תוסר כאשר החיידקים מוחדרים לתוך המכשיר. </li></ol> 5. צמיחה של E. ניעתי מאוד coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות לילה של E. coli RP437 עם הבעה GFP פלסמיד ב 20 מ&quot;ל של tryptone מרק (TB) בשעה 32 ° C עם רעד. הוסף בריכוז המתאים של אנטיביוטיקה כדי לשמור על פלסמיד. בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים נמוכה להעתיק pCM182 פלסמיד לאיתור חיידקים מבוסס על הקרינה במכשיר. עבור א coli, תרבויות גדל ב 32 ° C מומלצת תנועתיות גבוהה, כמו תנועתיות נמוכה בטמפרטורות גבוהות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תרבות לילה לחסן תרבות 20 מ&quot;ל של שחפת בקבוק 250 מ&quot;ל Erlenmeyer צפיפות אופטית ב 600nm של ~ 0.05. לגדול עם התרבות רועד ב 32 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים ב OD של 600 ~ 0.35 0.45 על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב XG 400 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים OD של 600 ~ 0.35 ב CB המכיל את chemoeffector בריכוז הצפוי באמצע הערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף RFP שכותרתו תאים מתים על OD של 600 ~ 0.35 ל-GFP להביע תאים חיים. המתים (אדום) התאים משמשים בקרה פנימית על מנת להבטיח כי כל הגירה היא לא בשל תופעות זרימה. </li></ol> 6. ניטור chemotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כמה מן CB המחט כניסת תאהרכזת. מילוי עם ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא בעדינות את המזרק 50μL עם התאים resuspended. צעד זה צריך להיעשות לאט כמו שוטונים יכול להיות טעון ו תפחית תנועתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המזרק 50μL לרכזת כניסת המחט, כפי שמתואר בשלב צעדים 4.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המכשיר על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה במהירות גבוהה לרכישת התמונה. מניחים את כניסת מזרקים (גם 500 מזרקים שיפוע μL ואת מזרק 50 תא μL) לתוך המשאבה מזרק וליזום תזרים כזה שיפוע נוצר ותאי זורמים דרך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים להיכנס לחדר chemotaxis, לחכות ~ 20 דקות עבור מערכת לייצוב לפני הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ירוק (חי) ואדום (מת) תמונות הקרינה במקומות שונים לאורך החדר (המקביל ל בזמנים חשיפה שונה). בדרך כלל, אנו אוספים 100 תמונות במיקום אחד ב 3 שניות במרווחים. </li></ol> 7. ניתוח נתונים: השלבים הבאים ניתן לבצע באמצעות ניתוח כלשהו זמין מסחרית תמונה התוכנית (למשל, ImageJ, Metamorph) או באמצעות קודי פשוט כתוב ב-Matlab. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקע פיקסלים בתמונה (כלומר, סף לקבוע עוצמת פיקסל ולהסיר את כל פיקסלים כי יש אינטנסיביות פחות מ סף). זה רעש ממזער בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש את המיקום של התאים המתים (אדום פלואורסצנטי) כדי לקבוע את מרכז התמונה. מאז תאים מתים להראות שום chemotaxis, זה מייצג את העמדה שבה תאים נכנסו לחדר chemotaxis ויהיה מזוהה בהעדר כל הגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור תאים חיים (פלואורסצנטי ירוק) בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את התמונה לתוך ערוצים לקבוע את מספר תאים חיים בכל ערוץ. בשנת העבודה הקודמת שלנו 3, 1050 הרחב מיקרומטר chemotaxis קאמרית חולקה 64 ערוצים, כי הם כל ~ 16 מיקרומטר רחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 7.1 7.3 לתמונות כל סכום ספירת תאים הכולל לכל ערוץ לאורך כל התמונות. זה נותן את מספר התא הכולל זוהה על כל ערוץ במשך כל תקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את מקדם החלוקה chemotaxis (CPC), המייצגת את כיוון הנדידה, כדלקמן: כל תא הממוקם בריכוז גבוה (מימין) וריכוז נמוך (משמאל) צידי תאים מתים מוקצה מכפיל של 1 ו -1 , בהתאמה. כלומר, תא נודד במעלה שיפוע מוכפל 1 בעוד התאים נע לאורך שיפוע מוכפלים ב -1. כל הערכים כפול מתווספים מעלה מנורמל למספר הכולל של תאים זוהה. לדוגמה, ערך עלות לקליק של 0.40 עולה כי 40% יותר חיידקים סך עבר לצד ריכוז גבוה מאשר בצד ריכוז נמוך (כלומר, chemoeffector מהווה attractant כמו חיידקים יותר התגלו נעה במעלה מדרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מקדם ההגירה chemotaxis (CMC), אשר שוקל את ההגירה של תאים על ידי המרחק נסע, כדלקמן: תא משקל לספור בכל ערוץ בפקטור כי הוא יחסי למרחק כי תאים נודדים. תא שזז לתפקיד ריכוז גבוה הרחוק (ערוץ 64) ניתנת גורם הניפוח של 1, ואילו אחד שזז לאמצע לצד ריכוז גבוה ניתנת גורם הניפוח של 0.5, ו - תא שעבר הרחוקה ביותר ריכוז נמוך המיקום משוקלל -1. לסכם את כל ספירת תא משוקלל לנרמל למספר תאים כדי להפיק את CMC. </li></ol> נציג תוצאות 3,4: השתמשנו במכשיר microfluidic (איור 1A) המתואר כאן לחקור chemotaxis של E. coli ב הדרגתיים של משיכה (חומצה אספרטית, autoinducer-2) ו דוחי (NiSO 4, אינדול) 3,4. אבטיפוס chemotaxis 5 זן E. coli RP437-GFP להביע שימש, יחד עם kanamycin-נהרגה E. coli TG1 תאים לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום כדי לפקח על תופעות זרימה. שיפוע הריכוז נוצרו המכשיר μFlow מוצג בתרשים 1B. כניסת התא היה כתרים כך שאין לזרום דרך אותו שיפוע יציב של 0 100 ng / mL של fluoresscein הוקמה בשנת המכשיר. עוצמת פיקסלים לרוחב המכשיר היה בשימוש כדי לקבוע את פרופיל ריכוז והעמסת. הנתונים מראים כי חיידקים המפגש שיפוע ליניארית כשהם נכנסים לחדר chemotaxis. 2A ו-B באיור מראה תמונות הקרינה של ה RP437 coli נודדות בתגובה הדרגתיים של חומצה אספרטית (0 100 מיקרומטר) ו NiSO 4 (0 225 מיקרומטר). התגובות שנצפו attractant אלה הקנונית ודוחה הם כצפוי. 3A איור מציג את התפלגות לכמת של E. coli RP437 בהעדר מפל ריכוזים (כלומר, שיפוע null של חומצה אספרטית), בעודאיורים 3 ב ו - ג המופע הפצה הדרגתיים של חומצה אספרטית ו NiSO 4. הספציפיות של התגובות הללו (כלומר, הטיה הגירה) בולטת כמו E. coli RP437 Δ זפת זן (כלומר, מאמץ חסר chemoreceptor טאר המשמש החיידק לחוש חומצה אספרטית ניקל ו) אין להדגים את הטיה הגירה בנוכחות מפל ריכוזים של חומצה אספרטית או NiSO 4. המגמות ניכרת את הפרופילים הפריסה המרחבית גם בקנה אחד עם ערכי על&quot;ל מחושב CMC. לקליק ערכי הגירה של E. coli RP437 ב הדרגתיים של חומצה אספרטית או NiSO 4 הן 0.33 ו -0.33, בהתאמה. הערכים המתאימים CMC הן 0.13 ו -0.14, בהתאמה. לעומת זאת, עלות לקליק CMC ערכים עם E. RP437 coli Δ זן הזפת הדרגתיים של חומצה אספרטית או NiSO 4 זניחים. בנוסף, עלות לקליק CMC ב שיפוע ריק של חומצה אספרטית הן 0.03 ו - 0.02, בהתאמה, מעידים על חוסר הטיה הגירה בהעדר צבע. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="איור 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="איור 1b" /> באיור 1. התקן סכמטית ואת שיפוע הריכוז. (א) ייצוג סכמטי של המכשיר chemotaxis microfluidic. המכשיר מורכב מודול שיפוע, ערבוב (20 x 100 x 18,750 מיקרומטר) ואת מודול תצפית chemotaxis (20 x 1,050 x 11,500 מיקרומטר). רוחב של שני ערוצי צבע הזנת המכשיר הן 500 מיקרומטר ו רוחב של כניסת חיידקים הוא 50 מיקרומטר. הבלעה מתארת ​​שיפוע של מולקולת האיתות (אפור) חיידקים נודדים בעקבות זאת. חיידקים חיים מתוארים אליפסות מוצק, ואילו החיידקים מתים מוצגים אליפסות פתוח. (ב) מפל ריכוזים בין 0 ל 100 ng / mL והעמסת נוצר המכשיר צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות Fluorescence נרכשו לאחר 30 דקות ו לכמת ידי ניתוח התמונה. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Chemotaxis של E. coli RP437 במכשיר microfluidic. E. coli RP437 נחשף שיפוע של (A) L-000-100 מיקרומטר aspartate או (ב) 0-225 מיקרומטר NiSO 4 במכשיר ואת נדידת חיידקים חיים (ירוק) כלפי aspartate-L או הרחק ניקל צילמו כל 2.5 שניות למשך 30 דקות. חיידקים המלח (אדום) שימש לשלוט על ההשפעות תזרים במכשיר. תמונות היו לכמת באמצעות in-house פיתחה ניתוח program3. הנתונים המוצגים הם נציג פסאודו בצבע תמונות מתוך שלושה ניסויים עצמאיים. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="איור 3a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="איור 3b" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="איור 3c" /> איור 3: כימות פרופילים ההגירה attractant קנוני ודוחה. הפריסה המרחבית של RP437 במכשיר microfluidic בתגובה (א) אחיד 100 מיקרומטר L-aspartate (כלומר, ללא שיפוע), (B) 0 100 מיקרומטר שיפוע של aspartate, ו - (ג) 0 225 מיקרומטר שיפוע של NiSO 4 . חלוקת תאים מתים מוצג כקו יציב, חלוקת תאים RP437 מוצג כקו מקווקו, ועל חלוקת תאים RP437 EDA + Δ זפת מוצג כקו מקווקו. הנתונים המוצגים הם ממוצעים של שלושה ניסויים עצמאיים.

<ol>
	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration.">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li><li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable,+Competing+Gradients.">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li><li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , (2009).</li><li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp;amp, M. a. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis.">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li></ol>

מקדם החלוקה chemotaxis (CPC) ואת מקדם ההגירה chemotaxis (CMC) יכול להיות מחושב כפי שמתואר מאו ואח&#39; 5. אם תא מזוהה בצד ריכוז גבוה, הוא מקבל ערך של 1, ואילו תא זוהה בצד ריכוז נמוך ניתנת ערך של -1. הערכים סיכם ואמר מחולק במספר הכולל של תאים כדי להפיק את העלות. הסימן של עלות לקלי?...

a microfluidic device for quantifying bacterial chemotaxis in stable concentration gradients

Chemotaxis מאפשרת לחיידקים להתקרב למקורות של כימיקלים attractant או להימנע ממקורות של כימיקלים דוחה. חיידקים מנטרים את הריכוז של chemoeffectors ספציפי על ידי השוואת הריכוז הנוכחי לריכוז זיהה כמה שניות קודם לכן. השוואה זו קובעת את כיוון נטו של התנועה. למרות מרובים, הדרגתיים מתחרים לעתים קרובות להתקיים בטבע, גישות קונבנציונליות על חקירת chemotaxis חיידקים הם לא טובים לכימות הגירה בתגובה הדרגתיים ריכוז ו דוחי משיכה. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל chemotaxis microfluidic להצגת הדרגתיים ריכוז מדויק ויציב של chemoeffectors כדי חיידקים כמותית בחקירת תגובתם הדרגתי שהוחל. המכשיר הוא צדדי כי הדרגתיים ריכוז של כל ריכוז מוחלט הרצוי כוח הדרגתי יכול להיווצר בקלות על ידי ערבוב diffusive. המכשיר הוא הוכיח באמצעות תגובת<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 הדרגתיים של חומצות אמינו ויונים ניקל.

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients at JoVE.com

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

a-microfluidic-device-for-quantifying-bacterial-chemotaxis-stable

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  Texas A&M University. פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

Video: A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

מחקרים Chemotaxis חיידקית שימוש מיקרופלואידיקה - ראיון

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV

Cell Capture Using a Microfluidic Device

תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Multi-פרמטרית Perifusion איילט מערכת בתוך התקן Perifusion Microfluidic

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...