כדי להתחיל, זרעו את 143B תאי אוסטאוסרקומה אנושיים בצלחת של שש בארות. ברגע שהתאים הופכים ל-75% נפגשים, החליפו את התווך בכל באר בתווך המכיל 10 מילימולר 13C4 אספרטט, ודגרו במשך שמונה שעות כדי להגיע למצב יציב לסימון התאים. לבידוד מטבוליטים, קררו את החיץ המוכן למשך הלילה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס או הניחו אותו על קרח יבש.
בינתיים, לוקחים צלחת מהאינקובטור ושואבים את המדיום מכל באר באמצעות פיפטה. שטפו אותו עם PBS פעמיים, ולאחר מכן הסירו את שאריות PBS לפני שתמשיכו הלאה. עכשיו מניחים את הצלחת על קרח יבש ולהוסיף 800 מיקרוליטר של חיץ מוכן לכל באר.
כדי להקל על ליזה התא, לדגור על הצלחת במשך 15 דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מגרדים כל באר על קרח יבש באמצעות מרים תאים, ומעבירים את הליזט לצינור מיקרוצנטריפוגה של 15 מיליליטר המונח על קרח יבש. מערבלים את הליזט במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, וצנטריפוגות אותו בארבע מעלות צלזיוס ו -17, 000 גרם במשך 10 דקות.
לאחר מכן מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ומייבשים אותו ברכז ואקום של ארבע מעלות צלזיוס עם מלכודת קרה תחת ואקום גבוה למשך כשש שעות. אחסנו את כדורית המטבוליט המיובשת בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לניתוח הדגימה באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית או LCMS, הוסף 100 מיקרוליטר מים בדרגת HPLC לגלולה ולמערבולת המיובשת כפי שהודגם .
צנטריפוגו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במהירות מרבית. לאחר מכן להעביר 25 מיקרוליטר של supernatant לבקבוקון LCMS, ולהזריק שני מיקרוליטרים לתוך מערכת LCMS. כדי לבצע כרומטוגרפיה נוזלית, השתמש בקצב זרימה קבוע של 0.15 מיליליטר לדקה, במצב הדרגתי של שלב B נייד מ 80 עד 20% למשך 20 דקות, 20 עד 80% למשך 0.5 דקות, והחזק ב 80% למשך 7.5 דקות כנגד שלב נייד A.לאחר מכן, בצע ספקטרוסקופיית מסה על ידי בחירת סריקה מלאה בין mz 70 ל -1, 000 דלתון.
ורזולוציה של 70, 000. הגדר יעד AGC של פעם אחת 10 עד השישית, וזמן הזרקה מקסימלי של 20 אלפיות השנייה. לאחר מכן, הגדר את זמן הריצה ל -16.5 דקות.
הקוטביות מוגדרת כחיובית. יעד AGC מוגדר לאחד בחזקת חמישה. הגדרת IT מרבית ל- 20 אלפיות השנייה.
וטווח סריקה מוגדר ליחס מסה לטעינה של 70 עד 1, 000. לאחר מכן הגדר את מתח הריסוס על 3.0 קילו-וולט. ואת נימי מחומם ב 275 מעלות צלזיוס.
בחר את זרימת גז הנדן ב -40 יחידות, את זרימת גז העזר ב -15 יחידות, ואת זרימת גז הטאטוא ביחידה אחת. עבור מעקב איזוטופים של גלוטמין 13C5, ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 75%, שנה את התווך לשני מילימולרי 13C5 המכיל גלוטמין, ודגר כדי להשיג מצב יציב של סימון התאים המעניינים. בודד ונתח את המטבוליטים כפי שהודגם בעבר.
לאחר בידוד וניתוח המטבוליטים, נתח את פעילות succinate dehydrogenase או SDH על ידי חישוב אחוז הסימון של 13C3 fumarate, 13C4 fumarate, 13C3 succinate, ו 13C4 succinate. לאחר מכן להעריך חמצון succinate ו fumarate הפחתת באמצעות הנוסחה. בתנאים שטופלו ברכב, קומפלקס SDH העדיף את הפעילות קדימה, והשילוב של 13C4 סוקצינאט לתוך 13C4 fumarate היה גבוה יותר מאשר 13C3 fumarate לתוך 13C3 succinate.
בתאי אוסטאוסרקומה שטופלו באנטימיצין, קומפלקס SDH העדיף את הפעילות ההפוכה, והשילוב של 13C3 fumarate לתוך 13C3 succinate היה משמעותי יותר מאשר 13C4 succinate לתוך 13C4 fumarate.
