הפעל את כל רכיבי הגדרת הרכישה עבור מדידת הפלואורומטריה. מניחים את צלחת תחתית הזכוכית בגודל 35 מ"מ המכילה את סיבי השריר המנותקים על במת המיקרוסקופ. בזהירות להסיר את התקשורת תרבית עם פיפטה 1, 000 מיקרוליטר, ולהחליף אותו עם 2 מיליליטר של פתרון רינגר בטמפרטורת החדר.
באמצעות מניפולטור מכני או ממונע, מניחים את שני חוטי הפלטינה בניצב לתחתית המנה. ודא שהדקי האלקטרודות מיושרים ביחס לציר האורך של הסיב, ובמרחק של כמה מילימטרים מקצות הסיב. התאם את מיקום האלקטרודה על ידי סיבוב הצלחת או הזזת כל אלקטרודה אם היא מותקנת על מיקרו מניפולטור עצמאי.
הפעל את האור המשודר ומצא את הסיבים בשדה הראייה באמצעות מטרה של 20 X. העבר את קוביית מסנן EGFP לנתיב האור. לאחר כיבוי האור המשודר, הפעל את נורת העירור 488 ננומטר באמצעות תריס אור הנשלט מרחוק.
כדי לזהות את הסיבים החיוביים ל-EGFP, מרכזו את הסיבים עם אות ה-EGFP הבהיר ביותר במרכז שדה הראייה. השתמש בסרעפת הממוקמת בנתיב אור העירור כדי למקד את אור העירור באזור מסוים של הסיב. זה מאפשר קליטת אותות, כאשר אות EGFP CaV1.1 הוא מקסימלי.
התאימו את מיקום הסיב לשלב המכני כדי ליישר קו עם נתיב האור של הסרעפת, ואחסנו את מיקום הסיב XY. לאחר החזרה ללוקליזציה הראשונה שנשמרה, הגדר את משך הזמן של שתי פעימות גירוי רציפות לאלפית שנייה אחת, משרעת ל -20 וולט, ואת קוטביות הפולסים לסירוגין. לאחר מכן, השתמש במתג הדק ידני כדי לספק את שתי הפעימות הרציפות.
במהלך הגירוי, שימו לב לשני התכווצויות סיבים הומוגניים קונצנטריים בתגובה לשני פולסים של קוטביות הפוכה. אם לא נצפתה התכווצות או רק התכווצות קונצנטרית אחת עם פולסי קוטביות לסירוגין, השליכו את הסיבים משאר הניסוי. הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת MTS 5 TAMRA 10 מילימולרית ישירות לצלחת, וערבב בעדינות עם פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר.
יש לדגור במשך ארבע עד חמש דקות כדי לאפשר דיפוזיה של מולקולת התיול הפלואורסצנטית לתוך מערכת הצינוריות הרוחביות לומן. באמצעות גירוי שדה, הפעילו גירויים חוזרים דו-קוטביים כדי לעורר רכבות פוטנציאליות לפעולה עוקבת בקצב של 50 הרץ למשך 300 אלפיות השנייה כל שנייה אחת למשך 5 דקות. הסר את פתרון מכתים מן הצלחת עם פיפטה 1, 000 מיקרוליטר.
והחלף אותו עם 2 מיליליטר של תמיסת רינגר בטמפרטורת החדר. הניחו לסיב המוכתם להתאושש מפרוטוקול הצביעה למשך 10 דקות לפחות. לאחר הערכה מחדש של בריאות הסיבים והפעילות החשמלית באמצעות שני פולסים לסירוגין, העבירו את קוביית מסנן MTS 5 TAMRA למסלול האור, והפעילו את אור העירור 533 ננומטר עם תריס אור הנשלט מרחוק כדי לאשר חזותית כתמים על הסיבים.
לאחר מכן, באמצעות המיקום המאוחסן על הבמה הממונעת, מקם את הסיב במרכז השדה עם קוביית מסנן MTS 5 TAMRA, הסרעפת ומטרת טבילת שמן 60X. לאחר שינוי כיוון חוטי הפלטינה לגירוי השדה בכל קצה של הסיב, יישרו את החוטים על הציר הראשי של הסיבים בקו ישר, ורחשו אותם חמישה מילימטרים זה מזה, כאשר הסיב במרכז. בתוכנת הרכישה, בחר את הפרוטוקול שישמש לרכישה.
שלב זה נשלט רק עם המחשב, ומפעיל את כל ההתקנים במורד הזרם לגירוי חשמלי ובקרת תריס נתיב אור. עבור כל פרוטוקול, צמצם את זמן הרכישה הכולל ככל האפשר כדי למנוע הלבנת אותות, אך אפשר כמה עשרות אלפיות שנייה של תאורת אור וקליטת אות לפני הגירוי החשמלי הראשון כדי להקליט קו בסיס. הפעל את הפרוטוקול על-ידי לחיצה על ביצוע.
האות המוקלט מוצג באופן אוטומטי על המסך. המשרעת הקטנה של האות והכיווץ המכני המהיר של הסיב מסתירים לעתים קרובות את רוב האות, ומציגים חפץ תנועה. הוסף 1 מיקרומולר של 100 מילימולר ובנזואיל פארא טולואן סולפונאמיד לתמיסת ההקלטה כדי למזער את התגובות החוזיות, ולהבדיל עוד יותר את האות הנובע מתנועות S4 עקב הפעלת סיבים.
לאחר מספר דקות, הפעל את אותו פרוטוקול פעם נוספת. חפץ התנועה הוסר כעת, אך נותר שינוי פלואורסצנטי קטן המתאים לתנועת S4. הזיזו מעט את המנה באמצעות השלב המכני כדי לקבל אות מאזור ללא סיבים או פסולת.
הפעל את הפרוטוקול בפעם האחרונה כדי להקליט את פלואורסצנטיות הרקע. יצא את העקבות והשתמש בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לבטא את האות כדלתא f מעל f 0 כפונקציה של זמן, והחל תיקון קווי בסיס במידת הצורך. הדוגמאות של תמונות מועברות ופלואורסצנטיות של השריר המנותח ולא מנותק המבטאות מבנה EGFP CaV1.1 מוצגות כאן.
התמונות המייצגות של סיב שריר המבטא מבנה EGFP CaV1.1 VS D3 לפני ואחרי צביעת MTS 5 TAMRA מוצגות באיור זה. צבע זה גם מכתים ציסטאין אנדוגני של סיבים שאינם נגועים. התמונות הקונפוקליות של מבנה EGFP CaV1.1 VS D3 וצביעת MTS 5 TAMRA מראות תבנית פס כפול האופיינית ללוקליזציה של CaV1.1 על מערכת הצינוריות הרוחביות של סיבי השריר.
ההקלטה הפלואורומטרית המייצגת בתגובה לשני גירויים ונמדדת באמצעות דיודת צילום מוצגת כאן. שני האותות מנורמלים על ידי הערך המינימלי שלהם ומתוארים כפונקציה של זמן ביחס לדפולריזציה שלהם. הקלטות אלה מראות כי השלב העולה והזמן לשיא האות דומים עבור שני הדפולריזציה המוטלת על הסיב.
