כדי להתחיל, לקחת את דגימת רקמה קלינית מעוכלת ומורחבת או טרייה ולהמשיך עם צביעת נוגדנים על ידי הצבתה בבאר אחת של צלחת תרבית תאים שש בארות. שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. בהתאם לגודל הדגימה, הוסף 0.5 עד 2 מיליליטר של הנוגדנים העיקריים במאגר הצביעה כדי לכסות את הג'ל כראוי.
יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. מוסיפים את הנוגדנים המשניים המתאימים ודגרים במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במאגר הכתמים הנבחר.
שטפו מחדש את הדגימה כפי שהודגם קודם לכן, והוסיפו 1 עד 2 מיליליטר של פוליאתילן גליקול לדגימה בצלחת בעלת שש בארות. הכתימו את הדגימה עם אסטר NHS מצומד Fluor 4 למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימה שלוש פעמים עם PBS.
לאחר מכן, כדי לבצע צביעת שומנים, יש לקחת את דגימת הרקמה המורחבת שנשטפה שלוש פעמים ב-PBS, למרוח צבע ליפופילי קונבנציונלי מדולל פי 200 ב-2 מיליליטר של 0.1% Triton X-100 או PBS למשך 72 עד 96 שעות בטמפרטורת החדר, ולשטוף לפחות שלוש פעמים עם PBS. כדי לבצע FISH, הכינו את מאגר ההכלאה על ידי שילוב של 2 x SSC, 10%dextran sulfate, 20%אתילן קרבונט ו-0.1%Tween 20. הניחו דגימות ג'ל הומוגניות במאגר הכלאה שחומם מראש ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר מכן, דגרו על דגימות הג'ל עם חיץ הכלאה המכיל 10 בדיקות FISH פיקומולריות כנגד גן המטרה למשך הלילה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. שטפו את הדגימות עם חיץ כביסה מחמיר פעמיים למשך 15 דקות כל אחת בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס ופעמיים במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם PBS למשך 10 דקות והמשיכו בהדמיה או באחסון הדגימה ב-PBS בתוספת 0.02% נתרן אזיד ב-4 מעלות צלזיוס.
כדי להרחיב ולצלם את הרקמה במלואה, העבירו את הדגימות המורחבות פי ארבעה ב-PBS לצלחת הדמיה בעלת תחתית זכוכית בעלת שש בארות. אם הדגימה הורחבה עוד יותר, חתכו אותה לחתיכות קטנות יותר. יש למרוח 0.1% פוליליזין על משטח הזכוכית.
הניחו את הדגימה על השקופית, והסירו את עודפי הנוזל סביב הג'ל בעזרת מטלית מעבדה מנייר כדי למנוע תזוזת ג'ל במהלך ההדמיה. לאחר מכן, בצעו הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי, מיקרוסקופ קונפוקלי או מערכת הדמיה אחרת לפי בחירתכם. לאחר ההדמיה, כווצו את הדגימות ב-PBS עם לפחות שלוש שטיפות של 10 דקות, מכיוון שאחסון לטווח ארוך במים שעברו דה-יוניזציה מוביל לפירוק האות הפלואורסצנטי.
לבסוף, לאחסן את הדגימות PBS עם 0.02% נתרן אזיד ב 4 מעלות צלזיוס. תמונות קונפוקליות של רקמת מוח עכבר מורחבת לחלוטין אפשרו הדמיה של חלבונים ומבני תאים וקרום מיטוכונדריאלי. כמו כן זוהו חומצות גרעין של רקמת בלוטות לימפה אנושית רשמית וקבועה המשובצת בפרפין.
לאחר הרחבה של פי 3.5 של קטע הכליה, נראה גלומרולוס מורחב ללא סדקים. עם זאת, עיגון לקוי או הומוגניזציה גרמו לסדיקות, עיוותים ואובדן מטרות מסומנות במקטע כליות אחר.
