Sonication of Formaldehyde-Crosslinked Caenorhabditis elegans and Chromatin Immunoprecipitation

התחל על ידי ערבוב ו aliquoting 90 עד 120 מיקרוליטר של פורמלדהיד crosslinked C.Elegans דגימות לתוך צינור סוניקציה פוליסטירן. הוסף נפח שווה של חיץ מתלים המכיל 2X חומרי ניקוי. סוניק בסוניק אמבט מים במשך שבע דקות.

מערבבים בעדינות את הדגימה על ידי פיפטינג וחוזרים על הסוניקציה במשך שבע דקות נוספות. לאחר שתסיים, העבר את הליזט הסוני לצינור של 1.5 מיליליטר. הוסיפו חצי נפח של חיץ מתלים ללא חומרי ניקוי.

לאחר צנטריפוגה ב 13, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, לחלק את supernatant lysate לארבעה חלקים. אחסן את חלק הקלט ליזט במינוס 20 מעלות צלזיוס בצינור של 1.5 מיליליטר. הוסף 0.5 מיקרוגרם של טרימתילציה אנטי-H3K9, אנטי-היסטון H3 או IgG לדגימת המשקעים החיסוניים או ה-IP המתאימים.

לדגור על התגובה בארבע מעלות צלזיוס לילה עם סיבוב. למחרת, aliquot את תשעת המיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מצופים חלבון G לכל דגימת IP בצינור 1.5 מיליליטר. לאחר שתי שטיפות עם מיליליטר אחד של FA-150, השהה מחדש את החרוזים המגנטיים במאגר FA-150.

לאחר שתסיים, הוסף 7.5 מיקרוליטר של תרחיף החרוזים המגנטי לכל תערובת נוגדני IP לפני הדגירה על הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם סיבוב. לאחר מכן, שטפו את החרוזים המגנטיים שבע פעמים באמצעות לפחות 200 מיקרוליטר מכל תמיסת חיץ. דוגרים על כל כביסה בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות עם סיבוב לפני איסוף החרוזים על מעמד מגנטי כדי לשאוף את הכביסה.

לאחר שאיפה את השטיפה האחרונה של החיץ, להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים ב 50 מיקרוליטר של חיץ אלוציה IP כרומטין, ולהעביר אותו לצינור 1.5 מיליליטר. לאחר הדבקת הדגימה ב- ThermoMixer, אספו את החרוזים על מעמד מגנטי והעבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש. חזור על elution עם עוד 50 מיקרוליטר של chromatin immunoprecipitation elution buffer.

לאחר שתסיים, משוך סך של 100 מיקרוליטר של supernatant לפני שתמשיך עם קישור צולב הפוך ו elution DNA.