כדי להתחיל, לשטוף את שלפוחיות חוץ תאיות קטנות מבודדות או SEV פעמיים על ידי אולטרה צנטריפוגה ב 110, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 70 דקות. להשעות מחדש את השלפוחיות ב 500 מיקרוליטר של פוספט חוצץ מלוחים או PBS. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיקרוליטר של מעכב פרוטאז 100X אליו.
יש להעביר את הדגימה לריסוק על-קולי ב-40 וואט למשך 10 דקות, עם זמן על-קולי של שלוש שניות, וזמן מרווח של חמש שניות. צנטריפוגה את התערובת כתוש ב 13, 700 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי supernatant שהתקבל, להוסיף dithiothreitol לריכוז הסופי של 50 מילימולר.
ולדגור אותו באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף 50 מיקרוליטר של יודואצטמיד טוחנת אחת לסופרנטנט. ולאפשר לו להגיב בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך.
צנטריפוגה את התערובת ב 13, 700 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ומעבירים את הסופרנאטנט המכיל את תמצית הפפטיד הגולמי לצינור אולטרה-צנטריפוגה של 10 קילודלטון. הסר חלבון מהפפטיד הגולמי על ידי צנטריפוגה של צינור הסינון האולטרה ב 13, 700 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
יבשו את השפכים שנאספו ברכז ואקום צנטריפוגלי בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. עבור התפלה, השתמש במים טהורים בדרגת ספקטרומטריית מסה כממס לכל הריאגנטים. ראשית, ממיסים את הפפטידים היבשים ב-100 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורצטית או TFA, ושומרים בצד.
לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של אצטוניטריל טהור לכל עמודת התפלה. צנטריפוגו את העמודים בטמפרטורה של 400 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הקולחים. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל לכל עמודת התפלה, וחוזרים על הצנטריפוגה כאמור לפני השלכת הקולחים.
לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 0.1% TFA לכל עמודת התפלה לפני צנטריפוגה כאמור. שוב, להשליך את הקולחים. כעת, הזרימו את פפטידים של התפלה לתוך עמודת ההתפלה.
צנטריפוגה את העמודות כאמור כדי לטעון את הדגימה. הוסף את השפכים המוחזרים בחזרה לעמודת ההתפלה כדי לחזור על העומס. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של 0.1% TFA.
צנטריפוגה כאמור, ולהשליך את הקולחים. לבסוף, הוסף 50 מיקרוליטר של 50% אצטוניטריל המכיל 0.1% TFA לפפטיד בעמודת ההתפלה. לאחר צנטריפוזיה, כאמור, לאסוף את השפכים בצינור צנטריפוגה חדש בדרגת ספקטרומטריית מסות.
