כדי להתחיל, להכין 10 עד 20 מיקרוגרם של RNA הכולל באיכות גבוהה לבידוד של RNA מועשר poly(A). העברת אליקוט של RNA לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ללא נוקלאז. לדגור על הצינור בבלוק חום ב 70 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להניח אותו על קרח במשך שתי דקות.
לאחר השעיית חרוזי האוליגו (dT), העבירו את הנפח הנדרש של תרחיף חרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר והניחו אותו על המגנט למשך שלוש דקות עד שהחרוזים המגנטיים יוצרים כדור. הסר את supernatant ולהוסיף נפח שווה של חיץ lysis. השהה מחדש את החרוזים.
החזירו את הצינור למגנט למשך שלוש דקות והוציאו את הסופרנטנט. לסבב הטיהור הראשון, הוסיפו חיץ ליזה לצינור דגימת הרנ"א וערבבו היטב. לאחר מכן מעבירים את התערובת לחרוזי אוליגו (dT) ומרחפים מחדש את הפיפטינג המלא לפחות 10 פעמים.
אפשר לדגור על הדגימות בסיבוב רציף בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, הניחו את הדגימה על מגנט למשך חמש דקות או עד שהסופרנאטנט נקי. השליכו את הסופרנטנט.
מוסיפים 600 מיקרוליטר של חיץ כביסה אחד לחרוזים ומערבבים בזהירות להשעיה. לאחר מכן, מוסיפים 300 מיקרוליטר של חיץ כביסה שניים לחרוזים ומערבבים בזהירות להשעיה. הניחו את הצינור על המגנט למשך חמש דקות או עד שהסופרנאטנט נקי.
השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, להוסיף 30 מיקרוליטר של קר 10 מילימולרי tris HCL לצינור הדגימה לדגור ב 70 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, להעביר במהירות את הצינור על המגנט.
וכאשר המתלה ברור, העבירו את הסופרנאטנט המכיל את הרנ"א המועשר בפולי(A) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. לסבב השני של הטיהור, הוסיפו 120 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לדגימת הרנ"א המדולל וערבבו היטב. לשטוף את החרוזים המשמשים בסבב הראשון של טיהור עם נפח שווה של חיץ ליזיס.
פיפטה 10 פעמים כדי להשהות מחדש את החרוזים ולאחר מכן להניח את הצינור על המגנט במשך חמש דקות לפני השלכת supernatant. מעבירים את תערובת החיץ RNA lysis לחרוזים שטופים ומערבבים היטב על ידי pipetting. לאחר שטיפת החרוזים כפי שהודגם קודם לכן, להוסיף 25 מיקרוליטר של 10 מילימולרי קר tris HCL לצינור הדגימה ולדגור ב 70 מעלות צלזיוס.
לאחר חמש דקות, העבירו במהירות את הצינור למגנט, וכאשר המתלה ברור, העבירו את הסופרנאטנט המכיל RNA מועשר בפולי(א) מדולל לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, להמרת ביסולפיט, העבר 19 מיקרוליטר של דגימת RNA מועשר פולי(A) מטוהר לצינור של 0.2 מיליליטר שמונה רצועות והוסף מיקרוליטר אחד של בקרת דוקרנים ביחס הכמות שנקבע מראש בין אחד ל -10, 000. לאחר הוספת 130 מיקרוליטר של מגיב המרה לצינורות וערבוב יסודי, מניחים את הצינור במכונת ה- PCR ומתחילים את תוכנית ה- PCR.
לאחר PCR, הניחו את העמודה על צינור האיסוף והוסיפו 250 מיקרוליטר של חיץ קשירת RNA לעמודה. לאחר מכן להעביר 150 מיקרוליטר של דגימה מטופלת bisulfite לעמודה פיפטה ביסודיות. הוסף 400 מיקרוליטר של 95 עד 100% אתנול לעמודה, סגור במהירות את המכסה והפוך מספר פעמים.
לאחר צנטריפוגות חוזרות ונשנות, שטיפה ונטרול עם חיץ דה-סולפונציה, מעבירים את העמוד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 20 עד 30 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז לעמוד ולאפשר לו לעמוד במשך דקה אחת. צנטריפוגה ב 10, 000 גרם למשך 30 שניות ב 25 מעלות צלזיוס ולהעביר 2.2 מיקרוליטר של supernatant לשמונה צינורות רצועה כדי להעריך את כמות RNA ואיכות.
יעילות העשרת ה-RNA של Poly(A) הוערכה על ידי בדיקת RNA כוללת של אלקטרופורזה נימית, וכתוצאה מכך ירידה בזיהום RNA ריבוזומלי לאחר טיהור כפול בשורות תאים סרטניים בלבלב. כמות ה-RNA לפני ואחרי הטיפול בביסולפיט הוערכה על ידי אלקטרופורזה נימית. לאחר הטיפול בביסולפיט, התפלגות גודל הרנ"א הראתה שיא של 200 עד 500 נוקלאוטידים בגלל פיצול שנגרם על ידי תגובת ביסולפיט.
אלקטרופורזה נימית של האמפליקון הראתה הכנה מוצלחת של הספרייה עם מינימום פריימר שנותר וללא שיא הגברה מוגזם. לאחר שקריאות הרצף מיושרות לרצף הייחוס, מופו הממוצע של 2, 440 מכלל הקריאות לרצף הדוקרנים, ושיעור ההמרה הכולל של C ל-T שנותח הגיע לממוצע של 99.81%
