Rat Retina Excision and Mounting on Porous Membrane for Calcium Imaging

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

338 Views

•

02:42 min

•

August 18th, 2023

DOI :

10.3791/200529-v

August 18th, 2023

•

Marina Cunquero¹, Maria Marsal¹, Gustavo Castro-Olvera¹, Steven T. Walston², F. Taygun Duvan², José Gabriel Macias-Montero³, Carles Puigdengoles³, Mokhtar Chmeissani³, Jose A. Garrido²^,⁴, Pablo Loza-Alvarez¹

¹Institut de Ciències Fotòniques (ICFO), The Barcelona Institute of Science and Technology, ²Catalan Institute of Nanoscience and Nanotechnology (ICN2), CSIC and BIST, Campus UAB, ³Institut de Física d'Altes Energies (IFAE), The Barcelona Institute of Science and Technology, Campus UAB, ⁴Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

Transcript

שבועיים-שלושה לפני ההדמיה, הזגוגית של עין חולדה מורדמת מוזרקת עם חלקיקים נגיפיים הנושאים את מחוון הסידן המקודד גנטית. באמצעות פונדוסקופיה ו- OCT, מבנה הרשתית נבדק לתגובות שליליות מהזרקת מחוון הסידן. שבועיים לאחר ההזרקה, שכבת תאי הגנגליון או GCL הציגה פליטה פלואורסצנטית.

לאחר מכן מתחילה כריתת הרשתית מהחולדה המורדמת. קח את העיניים המבטאות AAV2-CAG-GCaMP5G והסר את כל הרקמה המקיפה את גלגל העין באמצעות מלקחיים מעוקלים קטנים ומספריים קפיציים עדינים. לאחר מכן, קח פיסת נייר סינון בגודל שלושה על שלושה סנטימטרים.

הניחו אותו על כיסוי של צלחת בקוטר 3.5 ס"מ והרטיבו את נייר הסינון במדיום AIM. מקם את גלגל העין על הנייר כאשר החלק הקדמי מכוון לכיוון המפעיל. השתמש בזוג מלקחיים ישרים כדי להחזיק את גלגל העין בזווית של כ -45 מעלות מפני השטח של המנה.

השתמש ברווח בין המלקחיים הישרים כדי להנחות חתך עם להב. לאחר מכן לטבול את גלגל העין לתוך מדיום AIMS. השתמש במלקחיים ישרים ובמספריים קפיציים עדינים כדי להפריד בין החלק הקדמי והאחורי של העין.

הסר את העדשה בזהירות באמצעות שני זוגות מלקחיים ישרים ונתק את הרשתית מהסקלרה. בעזרת מספריים קפיציים עדינים, יש לבצע חתך בלובן העין לכיוון עצב הראייה ולחתוך עד להפרדת הרשתית בהצלחה מכוס העין. מעבירים את החתיכה הנכרתה של הרשתית אל קרום ההרכבה באמצעות פיפטה פלסטיק חתוכה.

לאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים ישרים כדי להרכיב שטוח את הרשתית, ולהבטיח ששכבת תא הגנגליון מכוונת כלפי מעלה. לאחר מכן, השתמש פיפטה פלסטיק מצויד קצה פיפטה 100 מיקרוליטר כדי להסיר את התקשורת, להקל על היצמדות של חתיכת הרשתית לקרום נקבובי. לאחר מכן, הפוך את המכלול על מערך אלקטרודות מיקרו או MEA, מיקום GCL על גבי האלקטרודות.

לאחר מכן מלא את האמבטיה לדוגמה עם מדיום AIMS מחומצן.