כדי להתחיל, הכינו את ארבעת גיליונות נייר הסינון, שכל אחד מהם בגודל 12.5 על 7.5 סנטימטרים. ערמו שני גיליונות יחד והניחו את הערימה במאגר העברה כדי לספוג דרכו. מניחים את קרום PVDF באתנול 95% ומסעירים את הממברנה על נדנדה למשך דקה אחת.
לאסוף את האתנול. לטבול את הממברנה במאגר העברה. ולהתסיס במשך שתי דקות.
לאחר מכן, הניחו את ערימת נייר הפילטר על משטח שטוח וניתן להזזה, כגון מכסה גדול ושטחו אותו באמצעות רולר. בעזרת משחרר ג'ל או פינצטה, מקם בזהירות את קרום PVDF על הערימה. לאחר מכן, הניחו גיליון בודד של נייר סינון יבש על הממברנה הזו והחליקו את הרולר על הנייר כדי לספוג כל חיץ עודף שנמצא על פני הממברנה.
הרימו את נייר הסינון העליון מבלי לשפשף את הממברנה. קחו דגימות סיבים מבודדים מהמקפיא והפשירו אותן בטמפרטורת החדר לפני הצנטריפוגה והשהו מחדש את הדגימה. הניחו טיפה של מיקרוליטר אחד מכל דגימה במרכז אזור הממברנה המיועד.
הימנע לגעת בקרום עם קצה פיפטה. אפשרו לטיפות הדגימה להיספג לחלוטין לתוך הממברנה למשך 15 דקות. לאחר מכן, באמצעות משחרר ג'ל או פינצטה, הרימו בזהירות את הממברנה מערימת נייר הפילטר הלח.
הניחו אותו על גיליון יבש של נייר סינון והשאירו אותו לפחות חמש דקות להתייבש. הפעל מחדש את הממברנה לאחר שכתמי הדגימה הפכו לבנים לחלוטין. לאחר מכן להמשיך עם immunolabeling חלבון היעד.
למד כיצד להשתמש בעוצמת לוח האותות כדי לסווג את עוצמת האיזופורמים MHC ואותות האקטין מתמונות כתם הנקודות. זיהוי חלבון מטרה חזק, בינוני וקטן מוצג על ידי אותות רוויים, בינוניים וחלשים בהתאמה. לזיהוי סוג הסיבים, השוו תחילה בין תוצאות השרשרת הכבדה של מיוזין IIA לבין תוצאות השרשרת הכבדה של מיוזין.
תעד את הסיבים המציגים איזופורם שרשרת כבד מיוזין יחיד עם עוצמת אות רוויה או בינונית. רשום את הסיבים שזוהו עם אקטין וללא זיהוי של מיוזין כבד שרשרת אחת או IIA כסוג פוטנציאלי 2X. אם קיים אות איזופורם קלוש של מיוזין כבד שרשרת עם אות אקטין רווי בינוני, רשום אותו כבלתי מזוהה.
יש להשליך דגימות עם חלבוני מטרה קלושים או שלא זוהו. אין להשתמש בסיבים המציגים אותות רוויים או בינוניים של MHCIIA ו-MHC1 להכנת סיבים ספציפיים לסוג הסיבים. לאחר MYO1D ID, הכינו דגימות מסוג אחת ושתיים על ידי שילוב סיבים עם אותות רוויים או בינוניים עבור איזופורם MHC המתאים.
יש להשתמש ב-10 מיקרוליטר מכל דגימה ספציפית לסוג הסיב ולהפריד אותם בדף ג'ל פריקאסט על ידי SDS, בהתאם להנחיות היצרן. השתמש במכונת הדמיה בג'ל כדי לזהות את איזופורם MHC המטרה, בהתאם לפרוטוקול היצרן. השווה את עוצמת האות של כל איזופורם MHC בכל הדגימות הספציפיות לסוג הסיב.
מזהה סוג הסיב מאושר על ידי איזופורם MHC הנכון בעוצמת אות בינונית או רוויה. תיוג חיסוני של כתם הנקודה איפשר זיהוי של סיבים מסוג שני, סיבים מסוג אחד וסיבים פוטנציאליים מסוג 2X. הדגימות הספציפיות לסוג הסיבים אומתו, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים לשרשרת כבדה של מיאוזין.
