Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic β-Cells Using MtPhagy Dye

המשך לביצוע ניתוח ציטומטרי זרימה של מיטופגיה של תאי בטא, עם תרחיף תא בודד של כ -100 איי שיקוף מבודדים מוכנים, המתאימים לכל תנאי ניסוי רצוי שייחקר. ראשית, יש להשהות מחדש את דגימות האיון עבור כל מצב ב-500 מיקרוליטר של מדיום זרימת איונים. הוסף 0.25 מיקרוליטר של מלאי MtPhagy לצינורות המיועדים לקבל את צבע MtPhagy.

באופן דומה, הוסף 0.25 מיקרוליטר של מלאי TMRE ומלאי פלואוזין-3-AM לצינורות הייעודיים המתאימים. עטפו את הצינורות ברדיד אלומיניום ומערבלו כל צינור במהירות נמוכה למשך חמש שניות כדי לערבב את התכולה. לאחר מכן לדגור את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

באמצע הדגירה, מערבלים כל דגימה במהירות נמוכה למשך חמש עד 10 שניות. לאחר הדגירה, צנטריפוגות את הצינורות ב 350 G למשך דקה אחת ב 10 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט.

ולהשעות מחדש את הדגימות ב 500 מיקרוליטר של מדיום זרימת איון. הוסף DAPI לצינורות המיקרוצנטריפוגות המכילות דגימות הדורשות טיפול DAPI. צנטריפוגה שוב ולהשליך את הסופרנאטנט כפי שהודגם בעבר.

להשעות מחדש את השאריות ב 500 מיקרוליטר של מדיום זרימת איון. לבסוף, הניחו את הדגימות על קרח ולאחר מכן המשיכו עם ציטומטריית זרימה. התאם את המתחים עבור פיזור קדימה או FSC ופיזור צדדי או SSC כדי להבטיח שאוכלוסיות התאים נמצאות במרכז חלקת הפיזור.

כדי לא לכלול כפולות, בשער מלבני בגובה FSC לעומת רוחב FSC, ואחריו גובה SSC לעומת רוחב SSC. התאם מתחים ופיצוי עבור DAPI כדי לסנן תאי בטא חיים. הגדר שערי פלואורסצנטיות עבור כל פלואורופור המשמש בהתבסס על דגימת RFD לא מוכתמת.

לאחר הקמת השערים, לאסוף 10, 000 אירועים לכל מדגם. תאי בטא עם ניצול גבוה של מיטופגיה הוגדרו כפלואוזין גבוה MtPhagy גבוה TMRE אוכלוסייה נמוכה ברביע השלישי או Q3. רמות מיטופגיות בזליות וואלינומיצין אופיינו הן באיים RFD והן באיים HFD.