Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC-MS/MS

כדי להתחיל, הכינו דגימות פרוטאום ופוספופרוטאום של השלפוחיות החוץ תאיות שבודדו מדגימות השתן בגישת EVtrap. הזריקו את הדגימות לתוך ספקטרומטר המסה של זמן הטיסה של ניידות היונים הלכודים דרך מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית. מפרידים את הפפטידים לעמודת C18 בקוטר 15 ס"מ.

לניתוח פרוטאומיקה, רכשו נתונים בשיטת dia-PASEF עם טווח מסה לכל רמפה בטווח שבין 300 ל-1200 יחס מסה-מטען וקבוע ניידות יונים מ-0.6 ל-1.50 1/Knot. עבור ניתוח phosphoproteomics, לרכוש נתונים באמצעות שיטת רכישת dia-PASEF. הגדר את טווח המסה לכל רמפה לטווח שבין 400 ל- 1550 יחס מסה למטען בקבוע ניידות יונים מ- 0.6 ל- 1.50 1/Knot.

טען את הקבצים הגולמיים לתוכנה פרוטאומית. הגדר את פרמטרי החיפוש במסד הנתונים של הומו ספיינס. עבור סוג תקציר, בחר ספציפי, ותחת אנזימים, בחר TrypsinP.

הגדירו את אורך הפפטיד למינימום של 7 ומקסימום של 52 ואפשרו שני מחשופים שהוחמצו. לאחר מכן הגדר את השינויים המשתנים המרביים ל- 5. השינוי הקבוע צריך להיות קרבמידומתיל בציסטין, ואילו השינויים המשתנים צריכים לכלול אצטיל חלבון N-טרמינל, חמצון במתיונין, וזרחן בסרין, תראונין וטירוזין.

לבסוף, הגדר את שיעור הגילוי הכוזב עבור התאמת ספקטרום פפטידים, פפטיד וקבוצת חלבונים ל- 0.01. בפרופיל הפרוטאומי LCMS ו- MS, 2% מכל דגימה גילו מעל 11, 000 פפטידים ייחודיים מכ -2, 200 חלבונים. יש לציין כי 72% מהחלבונים הייחודיים נמצאו באופן עקבי בכל שלושת הרפליקטים, וזוהו 90 סמנים וחלבונים מובילים של EV בהשוואה למסד הנתונים של ExoCarta.

דיוק כמותי אושר עם מקדם שונות נמוך-בינוני של 5.7% המסמל יכולת שחזור ואמינות גבוהה. עבור פוספופרוטאומיקה, 98% מכל דגימת פפטיד הניבה 800 פוספופטידים ייחודיים ו-350 פוספופרוטאינים. ההעשרה הניבה 72% פוספוסרין, 22% פוספוטריאונין ו-6% פוספוטירוזין.

42% מהפוספו-פפטידים זוהו בכל ההעתקים במקדם וריאציה בינוני של 21.8%, מה שמצביע על יכולת שחזור כמותית מקובלת.