High-Throughput Screening of Compounds Using Neutrophils Isolated from Human Blood in a 384-Well Plate Format

באמצעות פיפטה סרולוגית, שכבה בזהירות של ארבעה מיליליטר של דם אנושי heparinized על שמונה מיליליטר של תווך שיפוע צפיפות בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הדם ב 550G במשך 30 עד 50 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש פיפטה מיליליטר אחד כדי להסיר את השכבה העליונה המכילה פלזמה ותאים מונוגרעיניים.

אספו נויטרופילים מהרצועה העכורה התחתונה וכשלושה עד ארבעה מיליליטר מתחת לנוזל השקוף לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS. הפוך בעדינות את הצינור פעמיים עד שלוש כדי לערבב את מתלה הנויטרופילים. צנטריפוגה את תרחיף הנויטרופילים ב 400G למשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, ואז בזהירות לרוקן את supernatant מן הצינור ולהשעות מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של PBS.

שוב, צנטריפוגו את המתלים ב-300G למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, השתמש בשאיבת ואקום כדי לסלק שאריות סופרנאטנט על דופן הצינור וסביב פי הצינור. להשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תווך נויטרופילים.

שלב מיליליטר אחד של 1.2 מיקרוגרם לכל תמיסת נוגדנים מיליליטר עם 0.2 מיליליטר של תווך נויטרופיל בצינור 1.5 מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לבארות הבקרה השליליות בצלחת באר 384. בצינור של 15 מיליליטר, לשלב תשעה מיליליטר של תמיסת נוגדנים, 21.6 מיקרוליטר של תמיסת FMLP, ו 1.7784 מיליליטר של תווך נויטרופילים.

הוסף 25 מיקרוליטר של תערובת זו לבקרות חיוביות לבדוק בארות צלחת 384 באר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, מעבירים חמישה מיקרוליטרים של תמיסת תרכובת מצלחת ספריית התרכובת לצלחת באר 384. צנטריפוגו את המתלים ב-500G למשך דקה.

הוסף 20 מיקרוליטר של תרחיף נויטרופילים לכל באר באמצעות פיפטה 16 ערוצים. דוגרים על הצלחת על שייקר במהירות 300 סל"ד למשך 10 דקות. לאחר מכן כדי לתקן את התאים, להוסיף שלושה מיקרוליטר של 16% paraformaldehyde לכל באר, לדגור על קרח במשך 10 דקות.