SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

88 Views

•

02:57 min

•

January 26th, 2024

DOI :

10.3791/200806-v

January 26th, 2024

•

Danila Di Meo*¹, Josephine Ramazzotti*¹, Marina Scardigli*¹^,², Franco Cheli¹, Luca Pesce¹^,³, Niamh Brady¹, Giacomo Mazzamuto¹^,⁴^,⁵, Irene Costantini¹^,⁴^,⁶, Francesco S. Pavone¹^,⁴^,⁵

¹European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, ²Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, ³Department of Physics, University of Pisa, ⁴National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), ⁵Department of Physics and Astronomy, University of Florence, ⁶Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

Transcript

התחילו בהנחת חלקי המוח הקבועים בפורמלין, משובצים בפרפין בצלחות עם מכסי בורג. חברו את תמיסת הכיבוי לכלים, כסו אותם ברדיד אלומיניום ודגרו בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור במשך יום אחד. למחרת, העבירו את כל הדגימות למנות חדשות ודגרו עליהן עם פתרון ההפעלה כפי שהוצג קודם לכן.

בתום הדגירה, הכניסו את הדגימות לצינורות ושטפו אותן שלוש פעמים עם PBS במשך שעתיים תוך כדי רעידה. לאחר מכן הוסיפו תמיסת אינאקטיבציה לדגימות ודגרו לילה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ביצוע שלוש שטיפות, יש להוסיף תמיסת ניקוי לדגימות ולדגור באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד שבעה ימים.

בתום הדגירה שוטפים את הדגימות עם PBST בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות באינקובטור. למחרת, הוסיפו 10 מיליליטר של 30% מי חמצן לכל דגימה, ושטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות תוך כדי ניעור בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לחמם מראש את פתרון אחזור האנטיגן ל 95 מעלות צלזיוס באמבט מים.

מעבירים את הדגימות לתמיסה המחוממת ודגרים בחום של 95 מעלות למשך 10 דקות, ולאחר מכן 40 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. שטפו את הדגימות במים נטולי יונים, במשך חמש דקות תוך כדי רעידה. אזנו את הדגימות ב-PBS.

עכשיו להעביר את הדגימות לכלים עם מכסי בורג. לאחר הכנת תמיסת נוגדנים ראשונית טרייה לכל הדגימות בכד, יש להוסיף אותה לדגימות ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד שבעה ימים עם רעידות קלות בחושך. לאחר מכן הניחו את הדגימות בצינורות ושטפו אותן באמצעות PBST שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.

העבירו את הדגימות לצלחות עם מכסי בורג והוסיפו נוגדנים משניים שהוכנו ב-PBST ו-0.01% נתרן אזיד. מעבירים את הדגימות לצינורות ושוטפים אותן עם PBST מחומם מראש שלוש פעמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים תוך כדי רעידה. להתאמת אינדקס שבירה, מקמו את הדגימות בצלחות חדשות והוסיפו תמיסה של 30% של TDE.

לאחר מכן החליפו את 30%TDE בתמיסת 68% TDE בדגימות והשאירו אותן בטמפרטורת החדר תוך כדי רעידה. לאחר עיבוד קצר הושגה שקיפות אופטימלית והומוגנית של כל פרוסות הרקמה הן בחומר האפור והן בחומר הלבן.

Explore More Videos

JoVE

From the series

שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של המוח האנושי עם SHORT ו-LSFM