רכישה ואימות של מלכודות חוץ-תאיות של חולדות נויטרופילים (NETs)

כדי להתחיל, השהה מחדש את נויטרופילי החולדה המבודדים בארבעה מיליליטר של מדיית RPMI מוסיפה בצלחת פטרי סטרילית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של PMA לתרחיף נויטרופילים כדי להפעיל את היווצרות NETs. דוגרים על התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות תחת 5% פחמן דו חמצני.

עבור הבקרה השלילית, הוסף ארבעה עד חמישה מיקרוליטרים של DNASE1 לתרחיף הנויטרופילים כדי לפרק את רשתות ה-NET המופרשות. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטר HBSS כדי לשטוף את הרשתות. שטפו את הצלחת בארבעה מיליליטרים של מדיה תרבותית טרייה עבור כל צלחת כדי לנתק את הרשתות.

כעת, אספו את אמצעי הכביסה בצינור ופיפטה חדשים לעתים קרובות כדי להבטיח השעיה מלאה של הרשתות. צנטריפוגו את המתלה ב-300 גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים צפים. לאחר מכן, אספו את המדיום הסופרנטנטי עם רשתות בצינור חדש.

צנטריפוגה את המתלה של רשתות ותאים צפים בצלחת של 24 בארות עם פתקי כיסוי זכוכית של 1.4 ס"מ שהונחו בה כדי ליישב תאים צפים. לאחר מכן, תקן את התאים על פתקי כיסוי עם 4% PFA והמשך לאמת את הנוכחות של רשתות NET. לאחר מכן, הניחו טיפה של HBSS על מעמד מבחנה מכוסה סרט פרפין.

הפכו את הכיסוי לתוך טיפות HBSS כדי לשטוף אותו. לאחר השטיפה, לדגור את התאים ב 250 מיקרוליטר של 0.5x Triton X-100 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחדור אותם. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים ב- HBSS למשך דקה אחת.

אטמו את התאים בסרום חמורים 10% רגיל בטמפרטורת החדר למשך שעה. לבסוף, לדגור על התאים עם 70 עד 90 מיקרוליטר של נוגדנים נגד חולדות במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את הכיסוי ב-HBSS שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת.

כעת, יש לדגור על הנוגדנים המשניים בטמפרטורת החדר למשך שעה בחושך לפני שטיפת HBSS. הכתימו את גרעיני התא ואת שלדי הרשתות ב-70 עד 90 מיקרוליטר של DAPI. בצעו שטיפת HBSS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת.