כדי להתחיל, הסר את חוט השדרה של עכבר ערוף ראש שחולל עם PBS. השקיעו את חוט השדרה ב-DPBS קר בצלוחית פטרי על קרח. עם מחט של 18 מד ומזרק של 10 מיליליטר מלא DPBS קר, השתמש בשחול הידראולי כדי לבודד את חוט השדרה כולו במכסה מנוע זרימה למינרית.
העבירו את חוט השדרה לצלחת פטרי עם DPBS קרים שהונחו על חבילות קרח. באמצעות מיקרוסקופ בתוך מכסה המנוע של זרימה למינרית, הסר בזהירות את כל קרומי המוח הנראים לעין עם מלקחיים חדים. לאחר מכן, העבירו את חוט השדרה לצלחת פטרי ריקה והשתמשו בלהב אזמל כירורגי מס' 10 כדי לחתוך אותו למקטעים באורך שניים עד שלושה מילימטרים.
לדיסוציאציה אנזימטית של תאי עמוד השדרה, הוסף תערובות אנזימים 1 ו-2 לחתיכות חוט השדרה. מערבלים את האנזימים בצלחת מספר פעמים כדי להבטיח ציפוי אחיד של חוט השדרה. דוגרים על המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ומערבלים ידנית את המנה כל 10 דקות.
לאחר הדגירה, להוסיף 350 מיקרוליטר של DNAse I.מערבלים את המנה בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של DMEM קר בתוספת 0.5% FBS לפני ערבוב עדין. מיד להעביר את התוכן כולו צינור חמישה מיליליטר.
עם פיפטה P1000, לשלש בעדינות את הרקמה שלוש פעמים. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת פסטר מזכוכית בגודל תשעה אינץ' מחוברת כדי לטרפד בעדינות את הרקמה חמש פעמים נוספות. הניחו את הצינור זקוף למשך 30 שניות כדי לאפשר לרקמה לשקוע.
בעזרת פיפטה P1000, שאפו החוצה את הסופרנאטנט והעבירו אותו דרך מסנן של 30 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. לצינור עם הרקמות הנותרות, הוסף מיליליטר אחד של DMEM בתוספת FBS. לאחר מכן, טריטורינג בעדינות שלוש פעמים עם פיפטה פסטר.
לאחר שנותנים לרקמה להתיישב בתחתית, מעבירים את הסופרנאטנט דרך מסנן של 30 מיקרומטר ואוספים אותו לאותו צינור של 15 מיליליטר ששימש קודם לכן. צנטריפוגה את תרחיף התא המסונן ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש שואב ואקום כדי להשליך בזהירות את supernatant.
השתמש בתמיסת הסרת הפסולת המסופקת בערכת דיסוציאציה מוחית למבוגרים כדי להסיר את המיאלין מכדורית התא. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של DMEM בתוספת FBS לגלולה והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים כדי לערבב. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של DPBS בתוספת FBS.
שוב צנטריפוגה לפני השלכת הסופרנטנט. תיוג התאים עם Anti-ACSA-2 MicroBeads בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש בעמודות ההפרדה המגנטית כדי להפריד בין התאים באמצעות ברירה חיובית.
לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים ב 300 גרם במשך 10 דקות לפני השלכת supernatant. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של DMEM חם בתוספת FBS. העבר את תרחיף התא להמוציטומטר כדי לספור את התאים ולהעריך את כדאיותם.
התאם את ריכוז התאים ל 75, 000 תאים לכל 50 מיקרוליטר עם FBS DMEM. לאחר מכן, להעביר 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לכיסוי מצופה פולי-L-ליזין בצלחת 24 באר. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי.
לאחר מכן, הוסף בזהירות 450 מיקרוליטר של חם ואנטיביוטיקה בתוספת FBS DMEM לכל באר. נצפו בידוד מוצלח והתפשטות של מיקרוגליה ואסטרוציטים. ביום הרביעי, אסטרוציטים נצפו יוצרים תהליכים ארוכים יותר, בעוד תאי מיקרוגליאה סגלגלים עם צירים קצרים יותר נראו.
האסטרוציטים יצרו שכבה קונפלואנטית מחוברת ביום השביעי, כאשר תאי המיקרוגליה הציגו פחות ופחות תהליכים קצרים. מיון תאים אישר 92% עד 93% כדאיות התא של תרבית התא המבודדת.
