שימור תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות שימור קריוגני אופטימלי

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

40 Views

•

02:51 min

•

November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200824-v

November 3rd, 2023

•

Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Transcript

כדי להתחיל, לנתק את תאי אפיתל פיגמנט הרשתית הנגזרים hESC, להכין את השעיית התא, ולאחר מכן לספור את התאים. כעת, צנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 250 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שפכו החוצה את הסופרנטנט, ואז, השהו מחדש את גלולת התא באמצעי שימור בהקפאה.

לאחר מכן, להעביר מיליליטר אחד של תרחיף התא בקבוקון קריוגני 1.2 מיליליטר. מניחים את הבקבוקונים הקריוגניים במיכל הקפאה ומקפיאים למשך הלילה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. מעבירים את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

כדי להפשיר את הבקבוקונים הקפואים, תחילה מחממים את מדיום התרבית בחרוזים מתכתיים המחוממים ל -37 מעלות צלזיוס, ממלאים מראש 10 מיליליטר ממדיום התרבית המחומם בצינור 15 מיליליטר. כעת, הסר את הבקבוקונים הקריוגניים מהחנקן הנוזלי והכנס אותם למערכת הפשרה אוטומטית להפשרה מהירה. זרוק 0.5 עד מיליליטר אחד של מדיום התרבית שחומם מראש לתוך בקבוקון קריוגני כדי להבטיח הסתגלות הדרגתית של התא.

לאחר מכן, צינור 1.5 עד שני מיליליטר של השעיית התא לצינור 15 מיליליטר עם בינוני. צנטריפוגה את התאים ב 250 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט.

להשעות את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום חם. טען את התאים בהמוציטומטר וספור אותם כדי לקבוע את שיעורי ההתאוששות וההישרדות. תרממו את התאים המופשרים על צלחות מצופות קרום מרתף במדיום תרבית עם 27632 יו'.

תאי אפיתל פיגמנט הרשתית שהוקפאו ביום החמישי בשלב המעריכי שלהם הציגו קצב התקשרות גבוה יותר לאחר ההפשרה. יחסית למורפולוגיה המשושה האופיינית להם, התאים שקפאו בנקודות זמן אחרות היו בעלי פנוטיפ פיברובלסטי. תאי P2 ביום-חמישה הציגו ביטוי גבוה יותר וסמני תאים מקומיים כראוי 28 יום לאחר ההפשרה.

צוין כי אמצעי שימור הקפאה שונים הפגינו ביצועים טובים באותה מידה בהשגת כדאיות תאים גבוהה והתקשרות לאחר ההפשרה.

Explore More Videos

Human Embryonic Stem Cells

Retinal Pigment Epithelial Cells