כדי להתחיל, חממו מראש את ראשי יתושי האנופלס המנותחים בחיץ CCD ב 37 מעלות צלזיוס על בלוק חום במשך חמש דקות. מעבירים את הצינור עם ראשי היתושים לתנור הכלאה לסיבוב ב-37 מעלות. לאחר מכן, להעביר את כל התוכן של הצינור לתוך זכוכית שעון ניתוח.
בעזרת מלקחיים, הרימו את הראשים או כל אנטנה מנותקת וקבעו אותם במיליליטר אחד של הקיבוע המוקדם. ב nutator, לסובב את הראשים מראש קיבוע במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע דיסקציה של רקמות, ראשית, שטפו את הראשים במיליליטר אחד של 0.1% PBS-Tween על קרח.
לאחר מכן העבירו את הראשים לזכוכית שעון מנתח. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להסיר רקמות עניין מהראש עם מלקחיים חדים. החזק את החלק הקדמי של הראש עם המלקחיים ותפוס אנטנה עם מלקחיים נוספת מהבסיס.
באופן דומה, הסר את palps. העבירו את האנטנות והפאלפים לצינורות ריקים נטולי דנ"א/רנ"א המונחים על קרח. לייבש את הרקמה ב 400 מיקרוליטר של מגיב מייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן להחליף את מגיב מייבש עם 400 מיקרוליטר של מתנול מוחלט ורקמות לייבש לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הקיבוע, יש לייבש מחדש את הרקמות בסדרה בת ארבעה שלבים של תמיסות הידרציה מחדש מדורגות למשך 10 דקות על קרח. לאחר מכן לשטוף את הרקמות ב 400 מיקרוליטר של PBST במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לדגור על הרקמות ב 400 מיקרוליטר של תמיסת פרוטאינאז K במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הרקמות פעמיים ב 400 מיקרוליטר של PBST כדי לעצור את העיכול האנזימטי. לאחר הוספת הקיבוע הפוסט, שטפו שוב את הרקמה עם PBST לפני הכלאת הבדיקה.
השקיעו את הרקמה ב-400 מיקרוליטר של חיץ הכלאת בדיקה למשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את החיץ מראש הכלאה הרקמה ב 400 מיקרוליטר של חיץ הכלאה בדיקה מחומם מראש במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. החלף את חיץ הכלאת הבדיקה המחומם מראש ב- 400 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה מחוממת.
מניחים את הצינור בנוטטור למשך שני לילות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מניחים את הנוטטור בתוך אינקובטור מכוסה בקופסה. לאחר מכן, אגוז את הרקמה ב 400 מיקרוליטר של חיץ לשטוף בדיקה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
לאחר שטיפת הרקמות ב 5x SSCT, לדגור 400 מיקרוליטר של חיץ הגברה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה החוצה את חיץ ההגברה מהצינור. לאחר מכן מוסיפים תערובת של סיכות השיער המחוממות, H1 ו- H2. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של חיץ הגברה.
אגוז את הרקמה לילה בחושך בטמפרטורת החדר. כדי להרכיב את הרקמה, תחילה הניחו חמש טיפות של תמיסת הרכבה על מגלשת זכוכית. לאחר מכן, עם מלקחיים, לתפוס את דגימות רקמה שטף על ידי הבסיס שלהם.
יש לטבול ולשטוף בעדינות בסדרת טיפות תמיסת ההרכבה. לאחר מכן הרכבה עם פתרון הרכבה ומניחים כיסוי להחליק על הרקמה. יש לאטום את הכיסוי בלק לפני ההדמיה.
ניתוח HCR fiche של נקבת רקמת הריח של יתוש האנופלס גילה כי IR 41t1, IR75d ו-IR7t היו פחות נפוצים באנטנות. IR64a היה נפוץ פי שלושה משאר הגנים המועמדים. לוקליזציה משותפת של משפחות קולטני אורקו ו-IR25a נצפתה באנטנה וכן במישוש המקסילרי של היתוש.
דפוסי לוקליזציה משותפים מצביעים על כך שתאים חיוביים IR76b מבטאים IR25a, בעוד שתאים חיוביים IR8a לוקליזציה חלקית עם IR76b ו-IR25a.
