Injecting Fluorescently Labeled Antibodies in Live Drosophila Embryos and Imaging of Low Abundance Proteins

כדי להתחיל, מלא כל מחט בחמישה מיקרוליטרים של תמיסת ננוני GFP עם תווית Alexa Fluor. הניחו כיסוי בגודל 25 על 25 מ"מ על משטח מגלשת זכוכית. פיפטה 40 מיקרוליטר שמן Halocarbon על המגלשה ולהפיץ אותו לאורך היקף הכיסוי.

מתחת למיקרוסקופ ההזרקה, מקמו את קצה המחט כנגד קצה הכיסוי השקוע בשמן. כוונן את לחץ האוויר בהזרקה של PicoPump בהתאם. החלף את מגלשת הזכוכית הריקה בשקופית העובר דרוזופילה המוכנה.

הגדר את קצה מחט ההזרקה בניצב לציר הקדמי-אחורי של העובר. השתמש במניפולטור שלב XY כדי להנחות את העוברים לכיוון המחט עד שהקצה מגיע למרכז החלמון, ולשאוב פעמיים עד שלוש כדי להחדיר נוגדנים לתוך החלמון. עם מניפולטור שלב XY, להרחיק עוברים מהמחט לאחר ההזרקה ולעבור לעובר הבא.

יש לאפשר לעוברים לדגור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד להגעה לשלב ההתפתחותי הרצוי. לאחר הדגירה, זהה את העוברים תחת עדשה בעוצמה נמוכה עם תאורת שדה בהירה ועבור לעדשת 40X או 63X להדמיה חיה פלורסנטית ברזולוציה גבוהה. לאחר ההזרקה, יחס האות לרעש של קולטן החריץ משתפר באופן משמעותי בהשוואה לאיכות האות של immunofluorescence.

יתר על כן, הזרקת נוגדנים אפשרה אפיון זמני של לוקליזציה חריץ במרווחים של 45 שניות ללא אובדן נראה לעין של עוצמת האות על פני חלון הדמיה של חמש דקות. הדמיה חיה של פוספוטירוזין עוברי הראתה כי זרחן טירוזין מועשר מאוד בצמתים התלת-תאיים. בנוסף, נצפתה אוכלוסייה שנייה חדשה של אות פוספוטירוזין מתחת למרכז הממברנה האפיקאלית.

הדמיה דו-צבעית גילתה כי אוכלוסייה זו של אות פוספוטירוזין קרובה למיוזין המדיאלי. בנוסף, האוכלוסייה המדיאלית של פוספוטירוזין הציגה דפוסי התלכדות ופיזור פולסאטיליים דומים, כפי שמוצג עבור מיוזין מדיאלי.