כדי להתחיל, השתמש במלקחיים כדי להסיר כל שומן ורקמת חיבור מבלוטת הרוק submandibular מנותח של עכבר המתת חסד. לאחר מכן הניחו את הבלוטה בצינור איסוף עם תמיסת HBSS קרה כקרח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לחתוך את הבלוטה לחתיכות מרובעות של סנטימטר אחד.
מחממים 4% ל-50 מעלות, ויוצקים את התמיסה לצלחת של 35 מ"מ. יוצקים כמות קטנה של תמיסת האגרוז לצלחת נפרדת ומוסיפים לתוכו את חתיכות הבלוטה. ואז מערבלים את החתיכות באגרוז העודף כדי לצפות אותו.
הבא במקום ארבע עד שש חתיכות של בלוטה שטוח במנה הראשונה עם agarose. מניחים את המכסה על התבשיל ומעבירים לקופסת קרח, מכסים את הצלחת בקרח להתקרר ולהתייצב. כדי לחתוך את חתיכות הבלוטה, ראשית, להשתמש אזמל לחתוך בזהירות סביב בלוטה משובץ גוש agarose.
לאחר מכן, להחיל טיפה של דבק סופר על בלוק agarose ולצרף אותו לשלב של ויברטום. כעת מלאו את תא הוויברטום ב-PBS קר כקרח המכיל 1% פניצילין סטרפטומיצין. בעזרת אזמל חותכים את עודפי האגרוז ויוצרים רווחים של חמישה מילימטר בין כל פיסת בלוטה.
יישרו את להב הוויברטומה עם בלוק האגרוז והגדירו את נקודות ההתחלה והסיום של המקטעים. חותכים את בלוק הרקמה למקטעים בעובי 150 מיקרומטר במהירות נמוכה ורטט גבוה. לאחר חיתוך המקטעים, השתמשו במברשת צבע כדי להרים את הפרוסות והניחו אותן בכלי עם חומר RPMI שחומם מראש המכיל את האנטיביוטיקה.
כדי לתרבית את פרוסות submandibular, הראשון, להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיה RPMI לבארות של צלחת שש בארות. הכניסו מסננים של 0.4 מיקרומטר לתוך הבארות. לאחר מכן, בעזרת מכחול, בזהירות להעביר אחד עד שש פרוסות על כל מסנן.
לאחר מכן דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני. לאחר הקרנת כמה לוחות ניסוי עם קרינת גמא כדי לגרום לפציעה, להחזיר את הצלחות לאינקובטור. לאחר מכן, למלא את הבארות של צלחת באר 24 עם 500 מיקרוליטר של מדיה תרבותית.
בעזרת מברשת צבע, הרימו את הפרוסות מהמסנן וטבלו אותן בעדינות בבארות. דוגרים על הפרוסות בכתמי הגרעין הרלוונטיים. לאחר מכן לדגור את הפרוסות עם נוגדנים במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה.
השקיעו את הפרוסות באמצעי התרבות שלוש פעמים כדי לשטוף אותן. תנו לפרוסות לדגור בכל תמיסת כביסה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הקלטת ממרווח הדמיה דו-צדדי.
הדביקו את הספייסר לתחתית צלחת שש בארות עם תחתית זכוכית, ואז פיפטה של 50 מיקרוליטר מדיה לתוך הרווח במרכז הספייסר. הניחו את הפרוסה במדיה וודאו שהיא מונחת שטוחה. לאחר מכן עם פיפטה, בזהירות להסיר 20 מיקרוליטר של התקשורת מן הפער.
השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את הסרט מהצד העליון של הספייסר ולהניח כיסוי עגול 25 מ"מ להחליק מעליו. לחץ סביב קצוות המרווח כדי להבטיח חיבור יציב של החלקת הכיסוי. דמיינו את הפרוסה במיקרוסקופ קונפוקלי.
פרוסות לא מוקרנות של הבלוטה התת-לסתית שתורבתה במשך שבעה ימים שמרו על אות MT וארכיטקטורת אפיתל. עם זאת, בשלושה ימים לאחר הקרינה, נצפתה ניוון תאים acinar ו ductal. תאים חיוביים לקספז נצפו ארבעה ימים לאחר ההקרנה.
גמא H2AX מוגבר נצפה בפרוסות מוקרן, דבר המעיד על נזק לדנ"א in vivo. הדמיה בזמן אמת של מקרופאגים אישרה פאגוציטוזה של תאי אפיתל במודל תרבית הפרוסות. תאים בודדים יכולים להיות מזוהים ומפולחים לצורך ניתוח עוקב של התנהגות תאים, כגון הגירה.
