הכנה ותכנות מחדש של Lentivirus עבור תאי אדנוקרצינומה של צינור הלבלב

1 2 כדי להתחיל, ראה את תאי HEK 293T3 24 שעות לפני transfection 4 בצלחת 15 ס"מ המכילה GMEN. 5 דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 6 ו-5% פחמן דו חמצני 7 עד שהם מגיעים למפגש של 40% עד 50%. 8 תייגו שלוש שפופרות פלסטיק 15 מיליליטר 9 עם השם המתאים lentivirus.

10 הוסף 1.710 מיליליטר של מדיום סרום מופחת 11 ו 90 מיקרוליטר של מגיב transfection לכל צינור. 12 מערבבים את התכולה על ידי ערבול 13 לפני הדגירה על הצינורות בטמפרטורת החדר. 14 לאחר חמש דקות, מוסיפים את תערובת וקטור האריזה 15 למדיום הטרנספקציה ולמערבולת.

16 לאחר מכן הוסף 7.5 מיקרוגרם של וקטור תכנות מחדש 17 ואת פקד pWPT-GFP 18 לתערובת הטרנספקציה המתאימה. 19 מערבבים את הצינורות במשך שתי שניות 20 לפני הדגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. 21 כדי להדביק את 293T התאים עם כל לנטיוירוס, 22 טיפות, להוסיף תערובת DNA transfection לתוך הצלחת.

23 לדגור על התאים הנגועים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 24 ו-5% פחמן דו חמצני. 25 לאחר 14 עד 16 שעות, 26 מחליפים את המדיום ב-30 מיליליטר 27 מדיום טרי 293T 28 וממשיכים בדגירה במשך 60 עד 72 שעות. 29 התבונן בתאים מדי יום 30 ובדוק את יעילות הטרנספקציה.

31 לאחר מכן, להעביר את תרבית העברת הנגיף 32 לתוך צינורות 15 מיליליטר 33 ולהסתובב למטה ב 1, 932 G במשך 10 דקות 34 בארבע מעלות צלזיוס. 35 סנן את הסופרנאטנט הלנטיויראלי 36 באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרון 37 לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. 38 יום אחד לפני התמרה של לנטיוירוס, 39 להכין שתי בארות של צלחת 6 בארות 40 המכילה 100, 000 תאי PDAC לכל באר.

41 הכינו שני צינורות 15 מיליליטר 42 עם שני מיליליטר של מדיום PDAC שחומם מראש. 43 בצינור הראשון, 44 להוסיף 12 מיליליטר של תכנות מחדש lentivirus. 45 לאחר מכן להוסיף 12 מיקרוליטר של פוליברן 46 ולערבב על ידי pipetting.

47 לצינור השני, 48 להוסיף שני מיקרוליטר של פוליברן. 49 כעת מוציאים בזהירות את המדיום מכל באר 50 של צלחת 6 בארות 51 ושוטפים פעם אחת עם PBS בטמפרטורת החדר. 52 הוסף את מדיום הזיהום המתכנת מחדש 53 מצינור אחד לבאר הראשונה.

54 מוסיפים את התערובת מצינור שתיים לבאר השנייה. 55 דוגרים על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 56 עם 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן. 57 למחרת, החליפו את התווך 58 משתי הבארות בתווך PDAC טרי 59 והמשיכו בדגירה 60 עד 48 שעות כפי שהודגם בהמשך.