Tissue Embedding and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

כדי להתחיל, לבודד את אטריום שמאל ורידים ריאתי או PVs מן הלב של העכבר. הניחו את הרקמה המבודדת לתוך קריומולד כאשר בסיס הלב וקודקוד הריאה פונים כלפי מעלה. שחררו והתירו את הסבך של ה-PVs במקרה שהם מפותלים.

לאחר מכן, מלא את cryomold עם תרכובת OCT. באמצעות מלקחיים עדינים, יש להפעיל דחיסה עדינה על ה-PVs מבלי להזיז אותם כדי להסיר שאריות אוויר. מקפיאים את הרקמה בתרכובת OCT על קרח יבש.

עבור immunostaining, להפשיר את העכבר קפוא PV מחליק על מערכת צביעה במשך 20 דקות. לאחר מכן יש לטפטף מספר טיפות של תמיסת קיבוע פרפורמלדהיד 4% על המקטעים כדי לאבטח את הרקמה לשקופית. לאחר הדגירה, העבר את המגלשות למדף אנכי והטביע אותן במיכל מלא PBS.

הניחו את המכל על שייקר איטי למשך חמש דקות כדי לשטוף את המגלשות. בעזרת עט חוסם נוזלים המכיל קסילול, הקף כל מקטע בכל שקופית. ולארגן מחדש את השקופיות במערכת הצביעה.

בעזרת פיפטה של פסטר, יש למרוח טיפה אחת או שתיים של תמיסת חדירה על כל דגימה. לאחר מכן, נקה את פתרון Triton X-100 על ידי שטיפת המגלשות במשך חמש דקות ב- PBS. לאחר סידור מחדש של השקופיות במערכת הצביעה, הוסיפו טיפה אחת או שתיים של חיץ החסימה לכל מקטע, כדי להבטיח כיסוי מלא.

לאחר מכן, הכינו מיליליטר אחד של תערובת הנוגדנים הראשונית המורכבת מהנוגדנים הראשוניים והמאגר החוסן. מחק את מאגר החסימה שנותר מהשקופית. יש לתת שתיים או שלוש טיפות של תערובת הנוגדנים הראשונית לכל קטע.

לאחר הדגירה, הניחו את המגלשות במדף אנכי ושטפו את המגלשות במשך חמש דקות במאגר הכביסה תוך שמירה על תסיסה עדינה. לאחר מכן, להכין מיליליטר אחד של תערובת נוגדנים משנית המורכבת נוגדנים משניים חיץ כביסה. מקמו מחדש את השקופיות על מערכת הצביעה והשתמשו בפיפט כדי לפזר שתיים או שלוש טיפות של תערובת הנוגדנים המשנית על כל חלק.

לאחר מכן, נקו את המגלשות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת במאגר הכביסה תוך כדי טלטול. לאחר מכן, הוסף שתיים או שלוש טיפות של תמיסת Hoechst 33342 לכל קטע מסודר במערכת הצביעה. הניחו את המגלשות במדף אנכי ושטפו אותן במשך חמש דקות במאגר כביסה בתסיסה עדינה.

הוסף טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה פלואורסצנטי לכל שקופית ואטם את השקופיות בהחלקות כיסוי. אזור פתח ורידים ריאתי באטריום השמאלי ובצומת ורידים ריאתיים, ורידים חוץ-ריאתיים וורידים בין-ריאתיים נצפו תחת הגדלה של פי 10. אותות cTnT ספציפיים עם חתך שרירי אופייני בפתח ורידים ריאתיים, ורידים חוץ-ריאתיים וורידים תוך ריאתיים, נצפו בהגדלה של פי 40.

Cx43 נמצא בכל שלושת אזורי הריאה והוקרן בעיקר בין קרדיומיוציטים שכנים. אותות הקשורים ל- Cx43 נצפו בצד הקוטבי ובצד הצדדי של הקרדיומיוציטים בשרוולים של שריר הלב.