Drug Screening Using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Lysate Preparation for mRNA Sequencing

כדי להתחיל, הפשירו את בקבוקון הקריו של PBMC באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד שלוש דקות תוך היפוך עדין שלו. לאחר מכן מעבירים את התאים המופשרים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את בקבוקון הקריו במיליליטר אחד של מדיום צמיחה מלא וחם, והוסיפו את התמיסה טיפה לתאים בצינור החרוטי כדי לבצע את שלב הדילול הראשון.

כעת צנטריפוגו את מתלה התא למשך חמש דקות והטו את הצינור החרוטי באופן שוטף כדי להסיר את הסופרנטנט. להשעות מחדש את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום צמיחה מלא חם. לספירת תאים, ערבבו 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם כחול טריפאן.

ספור את התאים באמצעות 10 מיקרוליטר של תמיסת תאים מוכתמים, באמצעות מונה תאים אוטומטי או תא תא. השתמש במדיום גידול מלא חם כדי לדלל את התאים כדי להשיג ריכוז סופי של אחד פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר. לאחר מכן זרעו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת תרבית תאים בת 96 בארות.

מוסיפים 100 מיקרוליטר של דילול התרופה פעמיים לכל באר. כדי לקצור את התאים, צנטריפוגו את צלחת תרבית התאים למשך 10 דקות. השתמש במשאבת ואקום כדי להסיר את הסופרנאטנט תוך הנחת קצה המשאבה בפינה התחתונה של הבאר כדי לשמור על תאים.

עכשיו להוסיף 200 מיקרוליטר של PBS קר כקרח לכל באר. לאחר צנטריפוגה של הצלחת במשך חמש דקות, להסיר את supernatant. לאחר מכן להוסיף 15 מיקרוליטר של חיץ ליזה לכל באר.

בעזרת סרט איטום דביק, אטמו את הצלחת כדי להגן מפני זיהום. סובבו את הצלחת וצנטריפוגו אותה למשך דקה. לבסוף, לאסוף שישה מיקרוליטר של תמיסת התא lysed בצלחת PCR.