הכנת תאים לטיהור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם - הפטוציטים שמקורם בבני אדם

לאחר 27 ימים של התחלת התמיינות בכבד של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, שטפו את התאים עם שני מיליליטר PBS לכל באר. הכן את תמיסת האנזים במאגר ADS באמצעות הרכיבים הנתונים. מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסה לכל באר של צלחת שש בארות.

מניחים את הצלחת בחום של 37 מעלות על שייקר מסתובב למשך כשעתיים כדי לנתק את התאים מהצלחת. אשרו את ניתוק התא תחת מיקרוסקופ, ואז הפייטו את תרחיף התא כדי להתפזר לתאים בודדים, ואספו אותם בצינור של 50 מיליליטר המכיל את מדיום ההבשלה של הפטוציטים. צנטריפוגה את מתלה התא ב-200G למשך חמש דקות ב-18 מעלות צלזיוס.

ובאמצעות שאיפה, להסיר את supernatant. כדי להכתים את המיטוכונדריה של תאים, להשהות מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום התבגרות הפטוציטים המכיל 100 TMRM ננומולרי. לדגור על התאים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך הגנה עליהם מפני אור.

שוב, צנטריפוגו את מתלה התא והשהו מחדש את הגלולה באחד עד חמישה מיליליטר של חיץ ADS קר המכיל 2% FBS. לאחר ספירת תאים, aliquot 500, 000 תאים לצינור 1.5 מיליליטר ולתייג אותו כמו ללא בקרת נוגדנים ראשונית. צנטריפוגו את מתלה התא הנותר ב-200G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והסירו את הסופרנטנט.

הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל לכל מיליון תאים. מעבירים את תרחיף התא לצינור של 1.5 מיליליטר ודגורים על קרח למשך 50 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את תרחיף התא ושטפו את התאים פעמיים עם חיץ ADS קר המכיל 2% FBS.

כעת הוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל למיליון תאים לנוגדן הראשוני, תאים מוכתמים או לא מוכתמים, ודגרו במשך 30 דקות על קרח. שוב, צנטריפוגו את תרחיף התא ושטפו את התאים פעמיים עם חיץ ADS קר המכיל 2% FBS. לאחר השעיה מחדש של התאים במאגר ADS, סנן אותם דרך מסננת תא כובע הצמדה והנח את הצינור על קרח.