בדיקת שכפול תוך תאי לבחינת הפתוגנזה המולקולרית של שיגלה

זני שיגלה בעלי שלושה פסים על צלחות אגר המכילות צבע אדום קונגו כדי להבטיח שהמושבות יהיו ארסיות וכדי למנוע שימוש במושבות לא אלימות בבדיקות זיהום. בתור התחלה, קחו את תרבויות השיגלה שגדלו בן לילה וערבלו אותן. הוסף 100 מיקרוליטר של התרבית לחמישה מיליליטר של TSB טרי בצינור תרבית.

דוגרים על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות ב-250 סל"ד עד לקבלת צפיפות אופטית של 0.7 ננומטר. מעבירים 2 פעמים 10 ל-8 יחידות יוצרות מושבה של שיגלה תת-תרבותית לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מיליליטר. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 17, 000 גרם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

שאפו את הסופר-נאנט. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS חם, ומשעיפים מחדש את הגלולה ביסודיות. לאחר צנטריפוגה של התא שוב, להשהות מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של DMEM חם, ולסובב את השעיית התא.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של Shigella מרחף ומיליליטר אחד של DMEM לכל באר של HT29 monolayers אפיתל המעי הגס בשש צלחות באר. כדי להבטיח מגע חיידקי עם תאי HT29, צנטריפוגה את שש צלחות באר ב 2, 000 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס. דגרו על שש צלחות באר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% במשך 45 דקות.

כדי לקבוע את טיטר הזיהום החיידקי, הכינו דילולים סדרתיים פי עשרה של תאי שיגלה מרחפים מחדש ב- PBS. צלחת 100 מיקרוליטר של 1 פעמים 10 ל 5 ו 1 פעמים 10 ל 6 דילולים על לוחות אדומים קונגו עם TSB, ולדגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שואפים מדיה מכל באר.

מוסיפים מיליליטר אחד של PBS חם לכל באר, ושוטפים בעדינות. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של DMEM חם עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של gentamycin, ולדגור במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לשטוף תאי HT29 נגועים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS.

הוסף שני מיליליטר של DMEM חם עם gentamycin לכל באר, ודגר עד 24 שעות עבור שכפול תוך תאי ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, לשטוף תאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. הוסף מיליליטר אחד של PBS עם 1% Triton X-100 לכל באר כדי ליזה תאי HT29.

לאחר מכן באמצעות מגרד תאים או קצה פיפטה כפוף, לגרד את התאים lysed מן התחתית באר, ולהעביר את התערובת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר. מערבלים כל צינור למשך 30 שניות לפחות כדי להזיז עוד יותר את שיגלה מהתאים האיקריוטים הליזדים. הכינו דילולים סדרתיים פי עשרה של הליזטים וה-PBS.

צלחת 100 מיקרוליטר של דילולים סדרתיים על לוחות אדומים קונגו עם TSB, ולדגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס.