כדי להתחיל, להכין את SDS-PAGE ג'ל. סובבו את הסמן המופשר ואת דגימות בדיקת ההזזה התרמית התאית שהוכנו. הוסף 2.5 מיקרוליטר סמן לבאר הראשונה ו -20 מיקרוליטר דגימות לכל אחת מהבארות הנותרות.
לאחר מכן, הפעל את הג'ל ב 80 וולט. לאחר מכן, להוסיף 850 מיליליטר של מים טהורים במיוחד, 100 מיליליטר של אתנול נטול מים, ו 50 מיליליטר של חיץ העברה מהירה לכד, וערבבו היטב. חותכים את פלואוריד פוליווינילידן או קרום PVDF בהתאם לגודל הג'ל, ומסמנים אותו.
לאחר מכן, השרו אותו במתנול למשך 30 שניות כדי להפעיל אותו. הניחו את מהדקי ההעברה, משטח הספוג ושלוש שכבות של נייר מסנן העברה במגש המכיל את מאגר ההעברה. לאחר השלמת האלקטרופורזה, שפכו את תמיסת האלקטרופורזה ממכשיר האלקטרופורזה והוציאו את הצלחת.
הסר בעדינות את הג'ל עם סכין פלסטיק וחתוך אותו כדי לדמיין בבירור את סמן החלבון ואת חלבוני המטרה. לאחר שטיפת הג'ל בתמיסת transmembrane, להניח אותו שטוח על נייר פילטר. טבלו את קרום PVDF המופעל בתמיסת ההעברה.
החזיקו את הצד המסומן בפינצטה וכסו את הג'ל עם הפנים כלפי מטה. לאחר מכן, מקם את מערך ההעברה המורכב במיכל ההעברה. הוסף את הפתרון הטרנסממברנלי הנותר לקלטת הטרנסממברנה.
התאם את הזרם ואת השעה ולחץ על הפעל כדי להתחיל את ההעברה בטמפרטורת החדר. כעת, הוסף שישה מיליליטר של תמיסת 5% BSA עם TBST לקופסת הדגירה. לאחר השלמת ההעברה, הסר את קרום PVDF מההתקנה תוך הידוק צד הסמן והנח אותו בתיבת הדגירה.
לאחר הסרת תמיסת BSA מקופסת האינקובטור, הוסף שישה מיליליטר של נוגדן ראשוני. הניחו את קופסת הדגירה בקופסת קצף עם שקיות קרח למשך הלילה תוך כדי ניעור. למחרת, לאסוף את הנוגדן העיקרי בצינור, ולשטוף את הממברנה עם שישה מיליליטר של פתרון TBST.
לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר של נוגדן משני לקופסת הדגירה. בסוף הדגירה, לאסוף את הנוגדן המשני ולשטוף את הממברנה חמש פעמים עם TBST כפי שהוצג קודם לכן. מערבבים נפחים שווים של ריאגנטים כימילומינסנטיים A ו- B.Open את מערכת ההדמיה של הג'ל.
לחץ על דוגמאות, בדוק את הכיול והמתן להשלמת הכיול. לאחר מכן, לחץ על סמן ובדוק את הכיול. עכשיו להרים את הצד סמן של הרצועה עם פינצטה לטבול לחלוטין בתמיסת מגיב chemiluminescent.
הדקו צד אחד של הסמן כדי למקם את הרצועה עם הפנים כלפי מטה במכונת הצילום, וסגרו את מכסה מכונת הצילום. הגדר את זמן החשיפה לשנייה אחת ולחץ על לכידה. לחץ על שמור.
תן שם לתמונה ושמור אותה כקובץ TIFF. בדיקת השינוי התרמי התאית הראתה כי קסנטטין משנה באופן מדהים את היציבות התרמית של חלבון Keap1 בטווח טמפרטורות של 48 עד 57 מעלות צלזיוס בהשוואה לקבוצת הדימתיל סולפוקסיד.
