כדי להתחיל, קח תרביות של 12 יום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שהיו נתונים להשראת סמל עצבי. שאפו בעדינות מדיום C מהתאים. הוסף 100 מיקרוליטר PBS לסנטימטר מרובע של שטח פנים באר כדי לשטוף את התאים, ולאחר מכן להסיר את PBS.
הוסיפו נפח שווה של תמיסת ניתוק תאים לתאים ודגרו במשך 30 דקות תחת תוספת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף נפח שווה של מדיום NCC לצלחת. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית כדי לקצור את תרחיף התא ולהעביר אותו צינור חרוטי 15 מיליליטר.
סובבו את התאים ב-290G למשך שתי דקות בין 20 ל-25 מעלות צלזיוס. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. השתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר פיפטה 12 מיליליטר של מדיום NCC לכדורית התא.
מכנית פיפטה את המתלים למעלה ולמטה כדי ליצור מתלים. לאחר מכן, העבירו את מתלה התא ללוחית חיבור נמוכה במיוחד. ביום ה-14, סובבו בעדינות את לוחות תרביות התאים כדי לאסוף ספרואידים קטנים במרכז כל באר.
השתמש פיפטה מיקרו P1000 כדי לשאוף לאט את המדיום בילה מן ההיקף של כל באר. הזן מחדש את התאים עם הנפח המקורי של מדיום NCC. ביום ה-15, הסירו בזהירות את המדיום.
הוסף PBS לבארות כדי לשטוף את הספרואידים. לאחר מכן, להסיר PBS ככל האפשר, להבטיח spheroids אינם מופרעים. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון ניתוק התא לכל סנטימטר מרובע של שטח הפנים היטב.
לדגור על התאים בתמיסה במשך 30 דקות תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. עם פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, הוסף נפח שווה של מדיום ENC לכל באר. פיפטה מכנית הפתרון כדי לשבור את כל הספרואידים שנותרו.
לאחר מכן להעביר את התאים צינור חרוטי 50 מיליליטר. השליכו את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה כמו קודם. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים ב 5 עד 10 מיליליטר של מדיום ENC.
לספור את הריכוז של תאים קיימא באמצעות כחול טריפאן המוציטומטר. עכשיו, להוסיף נפח מספיק של מדיום ENC כדי צלחת על 300, 000 עד 400, 000 תאים קיימא לכל סנטימטר מרובע של שטח הפנים, וצפיפות של כ 1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, שאפו את הפתרונות מהבארות.
לאחר מכן, הוסף את התאים לצלחת עם בארות מצופות למינין PO / FN. תאי הזנה כל יומיים עם 200 מיקרוליטר של מדיום ENC לסנטימטר מרובע של שטח פנים באר עד ימים 30 עד 40. כדורים צפים חופשיים באיכות גבוהה עם משטחים חלקים נצפו לאחר השראת פסגה עצבית.
הספרואידים ביטאו את סמן הפסגה העצבית SOX10. נוירוטים נצפו בין הימים 25 עד 30 במהלך השראת נוירון אנטרי.
