כדי להתחיל, תייגו שלוש קבוצות של צינורות סטריליים של 1.7 מיליליטר וסט אחד של צינורות תחתונים חרוטיים סטריליים של 15 מיליליטר. מכינים צנטריפוגת דלי נדנדה עם תוספות צינור 15 מ"מ ומקררים מראש לארבע מעלות צלזיוס. קח את צלחת תרבית תאים שש בארות עם תאים נגועים 293FT.
שאפו את התקשורת מהבארות. מוסיפים 250 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA ודגרים ב-37 מעלות עד שהתאים מתחילים להתנתק. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מדיית בדיקה מוסיפה של 10% FBS לכל באר ופיפטה במרץ כדי ליצור השעיה של תא יחיד.
העבירו מיליליטר אחד של תרחיף תאים לצינורות 15 מיליליטר שסומנו מראש. הוסף מיליליטר אחד של 10% FBS בתוספת מדיית בדיקה לכל אחד מהצינורות הללו והפוך חמש פעמים כדי לערבב. ואז מיד להעביר 20 מיקרוליטר של השעיית התא כדי צינור להגדיר אחד.
עכשיו צנטריפוגה את צינורות 15 מיליליטר במשך חמש דקות ב 250 גרם בצנטריפוגה מקורר מראש. מערבבים 20 מיקרוליטר של כתם תאים כחול טריפאן עם תאים בקבוצה הראשונה וסופרים באמצעות מונה תאים או המוציטומטר. לאחר הסרת צינורות ה-15 מיליליטר מהצנטריפוגה, יש לשאוב מדיה מכדורי התא ולהשהות מחדש את הכדוריות במדיית בדיקה נטולת סרום ליצירת מתלה חד-תאי.
כדי לזקק תאים בלוחות 384 באר ושש בארות, הפוך את צינורות 15 מיליליטר מספר פעמים עבור תרחיף תאים הומוגני ולהעביר 500 מיקרוליטר לצינורות 1.7 מיליליטר בסט השני ולהגדיר שלוש. הוסף 0.5 מיקרוליטר של DMSO כדי להגדיר שניים ו 0.5 מיקרוליטר של ליגנד Halo 618 כדי צינור להגדיר שלוש ולערבב היטב. העבר את מתלי התאים DMSO וליגנד-חיובי לבארות נפרדות של מאגרים מגיבים.
השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להעביר 40 מיקרוליטר של כל תרחיף לצלחת תרבית 384 בארות. העבירו את התאים הנותרים לצלחות תרבית טריות בנות שש בארות לניתוח כתם מערבי עוקב ודגרו על צלחות של 384 בארות ושש בארות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. יש ליטול חומר בדיקה ללא סרום שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.
לדלל את מצע nanoluciferase מופשר 1:100 במדיה בדיקה ללא סרום ולהעביר אותו למאגר מגיב. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 10 מיקרוליטר של תערובת המצע לכל באר של צלחת תרבית 384 בארות. סובבו בעדינות את הצלחת למשך דקה.
הכנס את לוח 384 הקידוחים לקורא לוחות רב-מצבי ורשום את פליטות 460 ו- 618 ננומטר מכל הבארות עם תאים. חשב את יחסי BRET הגולמיים עבור רכב חיובי וליגנד-חיובי ביחידות מילי-BRET באמצעות המשוואה הנתונה. חשב את יחס BRET המתוקן על ידי הפחתת יחס BRET חיובי לרכב מזה של ליגנד-חיובי.
מוטציית הננו-CRAFS259A מפחיתה את אות ה-BRET בכ-45% ואת מוטציית הננו-CRAFS621A בכ-25%המוטציה הכפולה כמעט מבטלת את אות ה-BRE.
