הדמיה קונפוקלית ומדידות סינפטיות לניתוח גיזום גלומרולי סינפטי תלוי ניסיון בתקופה קריטית

כדי להתחיל, צלם שקופית והוסף לה שתי רצועות דקות של סרט הדבקה דו-צדדי כדי להתכונן להדמיה. פיפטה בערך 10 עד 15 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה בין שתי רצועות של סרט להרכבה במוח. העבירו את התווית drosophila brains לשקופית מיקרוסקופ עם קצה פיפטה P20 שטוף מראש עם PBS ו-0.2% Triton X-100.

לאחר העברת המוחות, השתמשו במברשת צבע עדינה כדי ליישר אותם, ולהבטיח שאונות האנטנה פונות כלפי מעלה. לאחר כיוון המוחות, כסו אותם בכיסוי זכוכית. לאחר מכן, מלא את הצדדים של coverslip עם אמצעי הרכבה נוסף.

אטמו את שולי הכיסוי בלק שקוף. לאחר ייבוש יסודי של המגלשה, אחסנו אותה במקרר להדמיה הבאה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד במטרה טבילת שמן 63X להדמיה.

השתמש בלייזר ארגון 488 והליום ניאון 543 להדמיית הגלומרולי הסינפטי של אונת האנטנה ונוירוני חוש הריח Or42a. קבע את הרווח וההסטה האופטיים עבור שני הערוצים. מקמו את הדימות במרכז המוח והתמקדו בגלומרולי VM7.

אתר בערך את החור באמצע המוח. בחר את רזולוציית ההדמיה של 1024 על 1024. לכוד הקרנה שלמה של מחסנית Z קונפוקלית דרך אונת האנטנה כדי להבטיח לכידה של עצבוב הנוירונים המלא Or42a של גלומרולי VM7.

טען את הגנוטיפ או המצב תמונה עיוורת לתוך פיג'י. כדי לפצל את ערוצי קווי הלייזר, עבור אל תמונה, לחץ על צבע ובחר ערוצים מפוצלים. בערוץ חוש הריח Or42a, גלול בערימת Z כדי לקבוע אילו פרוסות מכילות את עצבוב הנוירונים Or42a, תוך זיהוי ההתחלה והסוף של פלואורסצנטיות.

ליצירת הקרנת סכום פרוסות הכוללת רק פרוסות עם עצבוב נוירונים Or42a, לחצו על תמונה ועברו לערימות. לאחר מכן, לחצו על פרויקט Z, בחרו סכום פרוסות והזינו את הטווח הרצוי. השתמש בכלי לאסו בפיג'י כדי לעקוב אחר קווי המתאר של עצבוב הנוירונים Or42a בגלומרולוס VM7.

הכפל את היקף השטח העוקב במספר פרוסות ערימת Z ובעובי של כל פרוסה כדי לחשב את נפח העצבוב של גלומרולוס סינפטי VM7. לאחר חשיפה של 24 שעות לרכב ריח בקרה, עצבוב צפוף Or42a MCD:GFP נמשך בגלומרולי VM7 של שתי אונות האנטנה. לעומת זאת, חשיפה של 24 שעות לריח EB של 25% גורמת לגיזום משמעותי ולאובדן נפח גלומרולרי סינפטי.

הגדלת ריכוז ריח EB גורמת לגיזום גלומרולי סינפטי גדול יותר ויותר. כימות מייצג עבור טווח זה של ריכוזי EB odorant הראה תוצאות דומות עבור עוצמת פלואורסצנטיות ונפח עצבוב.