כדי להתחיל, הפעל את ארון זרימת האוויר הלמינרי, המאפשר לו להתייצב במשך שלוש דקות. יש לנקות ולחטא את המשטחים הפנימיים של הארון באמצעות חומרי החיטוי הבאים. לאחר חיטוי כל חומר שייכנס לארון, הכניסו לארון, מפיות וכפפות ניטריל.
לאחר מכן כבה את הארון וחשף אותו לאור אולטרה סגול למשך 15 דקות. לאחר ההקרנה, הפעל מחדש את הארון. הניחו את הריאגנטים בעיצוב הפריימר בצידנית מלאה בקרח.
לאחר חיטוי עם 70% אתנול, מניחים את המיכל בתוך הארון. הכינו את ההגברה האיזותרמית בתיווך לולאה, או תערובת LAMP, בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.6 מיליליטר. פיפטה את התערובת כדי הומוגניזציה שלה.
לאחר מכן, לדגור את הצינורות הסגורים בבלוק חימום ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן מצננים את הצינורות בצידנית פוליסטירן מלאה בקרח למשך חמש דקות. לאחר הקירור, הניחו את הצינורות בארון הזרימה הלמינרית.
כדי להשלים את תערובת LAMP, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של DNA פולימראז, ואחריו מיקרוליטר אחד של שעתוק הפוך. כדי לבצע זיהוי colorimetric, להוסיף את כחול dihydroxynaphthol. לאחר הוספת מגיב, פיפטה כל פתרון כדי לערבב כראוי את ריאגנטים LAMP.
לאחר מכן, פיפטה 22 מיקרוליטר של הפתרון לתוך צינורות PCR, נזהר לא ליצור בועות. עבור שליטה שלילית, להוסיף שלושה microliters של 0.1% pyrocarbonate מים. שמור בצד את כל הצינורות שנותרו להוספת חומר גנטי.
לאחר מכן, הסר את כל החומרים מהארון. לאחר חיטוי משטחי הארון באתנול 70%, כבו אותו. באזור נפרד, הוסף שלושה מיקרוליטרים של הדגימה לכל צינור PCR ופיפטה היטב עם מיקרופיפטה 20 מיקרוליטר כדי הומוגניזציה ביסודיות.
לפני תחילת התגובה הקולורימטרית, השתמש במצלמה באיכות גבוהה כדי לצלם את צינורות ה- PCR. עכשיו, לבצע את התגובה באמצעות מחזור תרמי ואמבט מים. עבור המחזור התרמי, מקם את הצינורות בבלוק התגובה והגדר פרופיל תרמי על הציוד.
אם אתה משתמש באמבט המים, מקם היטב את הצינורות במיכלים עגולים, ולאחר מכן מקם מיכלים אלה באמבט המים ב 66.3 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר זמן התגובה, הסר את הצינורות ואחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. אם בוצעה תגובה קולורימטרית, צלם תמונות של ה- PCR במצלמה באיכות גבוהה.
שיפוע טמפרטורה הראה כי טמפרטורת ההתכה האופטימלית הייתה 66.3 מעלות צלזיוס. ריכוז האנזים BST 3.0 הותאם ל-3.2 יחידות בינלאומיות למיקרוליטר. כדי להגדיר את האסטרטגיה הקולורימטרית, הוערך פנול אדום בצבעים אדומים ניטרליים.
עם זאת, לא נצפה שינוי צבע לאחר הגברה. סטנדרטיזציה של ריכוזים שונים של כחול הידרוקסינפתול בוצעה עם השינוי האופטימלי שהתרחש עם 125 מיקרומול של כחול הידרוקסינפתול. הדגימות המוגברות הדגימו שינוי בצבע בהתאם לריכוזן.
הגברת הדגימה אושרה עוד יותר על ידי אלקטרופורזה.
