זיהוי חלקיקים נגיפיים של SARS-CoV-2 בסופרנאטנט תאי Vero E6 נגוע ב- SARS-CoV-2

התחל על ידי ערבוב קזאין, אלכוהול פוליוויניל, polyvinylpyrrolidone ו BSA עם pH seven כדי להכין מאגר assay. לאחר מכן, הכינו 10% אימונוגלובולין G במאגר הבדיקה כדי להפוך את מאגר דילול הדגימה. הכינו את נפח תערובת חרוזי העבודה הדרושה לבדיקה.

לאחר מכן הפשירו את SARS-CoV-2 המוכן ושלטו בסופרנאטנטים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. תייג וסדר שמונה צינורות מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר כל אחד עבור SARS-CoV-2 ובקר סופרנאטנטים. כדי ליצור את הדילול הגבוה ביותר של כל סופרנטנט, ערבבו 600 מיקרוליטר של הסופרנאטנט עם מאגר דילול הדגימה בצינורות המסומנים כראוי, ולאחר מכן ערבבו לזמן קצר את הצינור כדי לערבב.

מעבירים ברצף 400 מיקרוליטר של האחד לסופרנאטנט מדולל אחד לצינור הדילול הבא. מערבולות קצרות כל סופרנאטנט מדולל לפני שממשיכים עם הדילול הבא. לאחר מכן קחו את תערובת חרוזי העבודה שהוכנה מראש לאחר ערבול במשך 30 שניות והוסיפו חמישה מיקרוליטרים לכל באר שהוקצתה היטב של צלחת מיקרוטיטר בעלת תחתית שטוחה של 384 בארות.

הוסף 45 מיקרוליטר של דילול supernatant מוכן לבארות שהוקצו המכילות מיקרוספרות בלוח 384 בארות. אטמו את הצלחת ודגרו למשך הלילה על שייקר מסלול ב-650 סל"ד בחושך ובטמפרטורת החדר. לאחר הסרת צלחת המיקרוטיטר מהשייקר המסלולי, צנטריפוגו את הצלחת במשקל 931 גרם למשך דקה אחת.

לאחר מכן הסר את אוטם הצלחת. כדי לשתק את החרוזים, הניחו את צלחת המיקרוטיטר על מפריד לוחות מגנטי למשך 30 שניות. כאשר לוחית המיקרוטיטר עדיין ממוקמת על המפריד המגנטי, שאפו את הסופרנאטנט מחרוזים משותקים מגנטיים.

לאחר הסרת צלחת המיקרוטיטר מהמפריד המגנטי, הוסיפו 60 מיקרוליטר PBST לכל באר המכילה חרוזים. לאחר מכן, קח חמש צינורות 1.5 מיליליטר כדי להכין תערובות גילוי שונות. הוסף נוגדן חד-שבטי אנושי נגד S1 ומקטעי משתנים חד-שרשרת המתויגים בדגל המכוונים לחלבון הספייק על חלקיק SARS-CoV-2 לכל צינור.

הוסף 50 מיקרוליטר לבאר של תערובת מתאימה בעלת שרשרת אחת, ספציפית למקטע משתנה, זיהוי ספייקים למיקרוספרות השטופות. אטמו את צלחת המיקרוטיטר ודגרו כפי שהוצג קודם לכן. ואז צנטריפוגה את צלחת microtiter.

שטפו מגיב לזיהוי ספייק עודף מחרוזים עם 60 מיקרוליטר PBST שלוש פעמים. לאחר מכן, הכינו תמיסה פלואורסצנטית המורכבת מאימונוגלובולין G מצומד PE, אנטי-אנושי יחד עם סגול מבריק עבור 21 נוגדנים מצומדים נגד FLAG. הוסיפו 50 מיקרוליטר לבאר של תערובת תמיסה פלואורסצנטית למיקרוספרות השטופות, ודגרו כפי שהוצג קודם לכן.

לאחר מכן סובבו את צלחת המיקרוטיטר. שטפו את תערובת התמיסה הפלואורסצנטית העודפת מהמיקרוספרות עם 60 מיקרוליטר PBST. להשעות את microspheres ב 60 מיקרוליטר של PBST משלב השטיפה האחרון.

לאחר מכן נתח את הצלחת במערכת ניתוח זרימה כפולה עם ההגדרות הרצויות. בדילול של סופרנאטנטים של תאים נגועים ב- SARS-CoV-2 בשני ערוצי הכתבים, נצפה אות תלוי ריכוז. שלושה מתוך חמשת מקטעים משתנים בעלי שרשרת אחת יכולים לזהות את הנגיף בדילול נמוך מאחד עד 18.

עבור שני המקטעים הנותרים של משתנים בעלי שרשרת אחת, הנגיף ניתן לזיהוי בדילולים נמוכים של אחד עד שישה.