כדי להתחיל, לאסוף את הדגימות המופשרות של רקמות מורין נגועות בסלמונלה עם זוג פינצטה. הכניסו אותו במהירות לתחתית תבנית פלסטיק המכילה אגרוז נוזלי. לאחר השלמת הפילמור השתמשו באזמל כדי לפתוח את תבנית הפלסטיק מהפינות.
לאחר הנחת להב על מיקרוטום, מעבירים את הדגימה עם אצבעות הכפפות לקופסת דגימה. מקמו את הדגימה מתחת למיקרוטום כך שהמשטח העליון של האגרוז יהיה באותה רמה כמו להב המיקרוטום. הזיזו את הבמה כדי למקם את קוביית האגרוז במרכז המטרה.
לחץ על כפתור פרוסה בתוכנת טומוגרף עד לקבלת פרוסה שלמה של הקובייה. לאחר מכן, מרכז את עדשת המטרה על דגימת הרקמה בכיווני x ו- y. הפעל את תוכנת הלייזר, התאם את אורך הגל ל -800 ננומטר ולאחר מכן הפעל את הלייזר.
סגור את דלתות הארון של המיקרוסקופ. לאחר מכן כבו את כל מקורות האור בחדר. הפעל את PMTs והגדר את המתח ל 750 וולט.
כעת כוונו את תריס המיקרוסקופ לאוטומטי. לאחר מכן הגדר את המתחים של V1 ו- V2 ל- 20 ו- 1.71 בהתאמה. התאם את ציר z עם התקן z-piezo עד שהוא מגיע לפני השטח של הרקמה.
חותכים פרוסות מרובות בעובי 50 מיקרומטר. לאחר מכן, כדי למצוא את קצוות הדגימה להגביל את אזור ההדמיה לרקמה עם הדמיה מינימלית של האגרוז שמסביב. לאחר כיבוי ה-PMTs, הגדר את אורך גל הלייזר ל-800 ננומטר.
השתמש בנקודת הלייזר כדי למצוא את הקואורדינטות של קצוות הרקמה תוך כדי הזזה של הבמה. לאחר אישור הקואורדינטות מקם את נקודת הלייזר במרכז הקדמי הימני. כעת שנו את אורך הגל ל-940 ננומטר.
הגדר את תריס המיקרוסקופ למצב אוטומטי, ולאחר מכן הגדר את מתח התריס ל- 20 עבור V1 ו- 1.71 עבור V2. הקש על אפשרות ההגדרה 3D Mosaic כדי להתחיל בסריקה. לאחר ההדמיה, לאסוף את קטעי הרקמה ממיכל המים. כדי לתפור את תמונות האריח, העבר תחילה נתונים משרת הטומוגרף למחשב Linux.
פתח את קובץ ה- Script של MATLAB StepOneStitchingAndArchive. m ואתר את תיקיית המקור. עבור לכרטיסייה עורך ולחץ על הפעל.
פרטי ההתקדמות יוצגו בחלון הפקודה. אתר את התמונות התפורות בתיקיית המשנה הנקראת stitchedimages_100 בתיקיית המקור. דחסו את הנתונים הגולמיים באמצעות הפקודה tar, ושמרו אותם כקובץ יחיד עם סיומת שם הקובץ tar.bz2.
כדי לאמן את מכונת וקטור התמיכה, הצג תצוגה מקדימה של התמונות התפורים. פתח תמונה אחת עם אותו שם קובץ מכל תיקיית משנה עם פיג'י. מזג את שלושת הערוצים לתמונה צבעונית אחת, ולאחר מכן התאם את הבהירות של כל ערוץ עד לקבלת אותות ברורים מחיידקים ורקמות אוטופלואורסצנטיות.
שים לב לרמת העוצמה המרבית המותאמת של כל ערוץ. לאחר מכן, פתח את סקריפט MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. הגדר את תיקיית המקור ואת שמות התמונות להדרכה, ולאחר מכן עבור לכרטיסייה עורך ולחץ על הפעל.
כאשר מופיעה תיבת דו-שיח המבקשת ספי צבע, מלא אותה בערכים המבוססים על הבדיקה הידנית הקודמת עם פיג'י. בחר אזורים עבור רקע ואזורי עניין בהתאם לתיבות הדו-שיח. יופיעו גרפים המראים עד כמה המודל אומן, ושואלים אם יש צורך להוסיף אזורים נוספים.
הוסיפו עוד אזורי עניין ורקע עד שניתן יהיה לפלח את החיידקים בצורה ברורה. תהליך הפילוח יפעל באופן אוטומטי, וניתן לראות את ההתקדמות בחלון הפקודה. לאחר מכן, פתח את תמונות הערוץ הכחול, המכיל אותות הרמוניים שניים של קולגן.
כופפו כלפי מטה את תמונות הערוץ הראשון פי עשרה הן בצירי x והן בצירי y ושמרו את התמונות שהוקטנו בתיקייה חדשה. צור שלושה עותקים משוכפלים של תמונות בגודל מוקטן באותה תיקייה. עבור ההדמיה התלת-ממדית, הפעל את חבילת התוכנה לתצוגה חזותית של Imaris בתצוגת Arena.
כעת פתח את קובץ IMS או TIF. התאימו את ייצוגי הצבעים של הערוצים השונים בחלון התאמת התצוגה. לחץ על מאפייני תמונה בתפריט עריכה כדי להגדיר ידנית את ערכי המינימום או המקסימום וערך לתיקון גמא.
לאחר התאמת מראה התמונה, יצאו את התצוגה הנוכחית בעזרת הכלי תצלום בזק. השתמש במצביע הניווט כדי למצוא תצוגה, ולאחר מכן השתמש בתוספת הוסף כדי להוסיף מסגרות ראשיות. השתמש בסמל הנפשה כדי לייצג את הנתונים התלת-ממדיים כסרט.
לחץ על כפתור ההקלטה האדום כדי לבנות את הסרט ולאחר מכן שמור אותו בתיקיית היעד ובסוג הקובץ הרצויים. תאי סלמונלה בודדים התגלו באיברי עכבר שלמים, כגון הטחול, הכבד, בלוטות הלימפה המזנטריות ומדבקות פייר. פילוח של חיידקים פלואורסצנטיים אושר על ידי אימונוהיסטוכימיה.
תאי המאכסן הוכתמו in vivo על ידי הזרקת נוגדן לסמנים על פני השטח לפני הזילוח.
