בידוד וחיתוך של אזור מותני חוט השדרה של עכבר ליצירת פרוסות אורגנוטיפיות לבדיקות טיפול רגנרטיבי

כדי להתחיל, להשיג את האזור המותני של עמוד השדרה של הגור בצלחת המכילה מדיום דיסקציה קר. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו דיסקציה ומספריים, חותכים את עמוד השדרה לאורך ציר הסגיטל. בעזרת פינצטה ישרה, הסר בעדינות את חוט השדרה מחלל עמוד השדרה וקילף בזהירות את קרומי המוח מהאזור המותני המבודד של חוט השדרה, או SC. מעבירים ודגרים על האזור המותני המבודד SC בתווך דיסקציה קר וטרי למשך 10 עד 15 דקות.

בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק, מניחים את הרקמה על סיפון החיתוך של מכשיר המסוק בניצב ללהב. לאחר הסרת מדיום הדיסקציה השיורי, המשך עם החתך האוטומטי של SC. בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים את הפרוסות ודגרים עליהן באמצעי דיסקציה טרי בכלי של 35 מ"מ למשך 15 דקות. שטפו את פני השטח של קרום הטיפוח שלוש פעמים עם מדיום אורגנוטיפי, או OM, והשאירו מיליליטר אחד של מדיה בתחתית עלון הממברנה.

בחנו את הפרוסות תחת מיקרוסקופ סטריאו דיסקציה וזרעו את מספר הפרוסות הרצוי על תוספות הממברנה המותנות. לאחר התאמת כיוון הפרוסות והסרת עודפי המדיום, דוגרים עליהן בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את העלון לצלחת פטרי חדשה והוסיפו מיליליטר אחד של OM טרי בתוספת GDNF בתחתית תוספת הממברנה.

דוגרים על הפרוסות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ביום ex vivo אחד, להחליף את המדיום הישן עם OM טרי. ביום השלישי, עברו למדיום השתלה בתוספת GDNF, והוסיפו GDNF טרי למדיום כל יום עד היום השביעי. עבור שאר הטיפוח לטווח ארוך, הוסף GDNF רק כאשר המדיום משתנה.

בדיקת אימונופלואורסנציה של פרוסות אורגנוטיפיות של עכבר מתורבת לטווח ארוך חשפה תפוצה רחבה של הסמן הציטו-שלד נוירופילמנט והסמן העצבי הגרעיני RBFOX3, המעידים על מצבם הבריא וזהותם העצבית.