כדי להתחיל, מניחים את צינור 15 מיליליטר המכיל מגיב עיכול תאים אנזימטי שחומם מראש באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. Aliquot 500 מיקרוליטר של PBS / EDTA מוכן טרי לתוך בארות של צלחת 24 בארות. תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, להתבונן בצמיחה של אורגנואידים מעיים אנושיים תלת מימדיים מובחנים וטרנסוולים.
העבר את תוספות תרבית התאים ממדיית הגידול לתמיסת PBS/EDTA. הסר את אמצעי התרבית מהצד האפי והחלף אותו ב- 100 מיקרוליטר PBS/EDTA מבלי להפריע לשכבת התא. לאחר השלכת PBS/EDTA, הסר את העלון מהבאר, כתם אותו בעדינות על קצה מגבת נייר והפוך.
בעזרת להב אזמל חד, חותכים סביב ההיקף הפנימי של הממברנה כדי להסיר את הקרום מהחדרה. מעבירים את הממברנה עם מלקחיים לצינור 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר מגיב עיכול תאים אנזימטי שחומם מראש. מניחים את הממברנה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני.
כל 10 דקות, פיפטה את כל עוצמת הקול חמש פעמים באמצעות פיפטה P 200. העבר, מיקרוליטר אחד או שניים של תרחיף תאים לשקופית זכוכית כל 10 דקות כדי להעריך דיסוציאציה על ידי הערכה איכותית של אחוז התאים הבודדים. לאחר הדיסוציאציה, יש לשלב שלוש בארות משוכפלות לכל מצב בצינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד של 1.5 מיליליטר.
מוסיפים 400 מיקרוליטר של מדיום התמיינות תרבית תאים המכיל 10 מעכבי ROCK מיקרומולרי ומערבבים בעדינות על ידי פיפט. מסננים את כל הנפח דרך מסננת קצה 70 מיקרון, ואוספים את הזרימה בצינור טרי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סנן את הזרימה המתקבלת דרך מסננת 70 מיקרון על מסננת קצה 40 מיקרון.
הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של 0.4% טריפאן כחול לחמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים וספרו תאים בודדים בני קיימא. לדלל את המדגם עם מדיום גידול WRNE כדי לקבל 1, 000 תאים למיקרוליטר. בסך הכל 5, 623 תאים בודדים בודדו מאורגנואידים ממוינים של מעיים אנושיים שגדלו על תוספות תרבית תאי ממברנה.
