בנייה בקנה מידה גדול של פלסמידים UAS-cDNA/ORF על ידי הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass)

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

80 Views

•

02:25 min

•

May 17th, 2024

DOI :

10.3791/201691-v

May 17th, 2024

•

Si Xu*¹^,², Mengyu Chen*¹^,², Guang Chen¹^,³, Si Luo⁴, Wen Xue¹^,², Xuelian Liu¹^,², Jiwu Wang¹^,²^,³, Ping Wei⁴

¹Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ²Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

Transcript

כדי לבצע את תגובות המבחנה הדו-שלבית המקבילות של המכלול המודולרי מבוסס הקריספר או CRISPRmass, המשך לבקע את עמוד השדרה הווקטורי הזהה של פלסמידים cDNA/ORF על ידי Cas9 sgRNA בתגובת מבחנה שלב ראשון. לשם כך, סדרו צינורות 0.2 מיליליטר מסומנים כראוי בבלוק קירור אלומיניום על קרח. הכינו את תערובת האב למספר N של תגובות על ידי ערבוב כמויות מתאימות של Cas9, sgRNA, מאגר Cas9 ומים שטופלו ב-DEPC.

לאחר הוספת רכיבי תערובת האב יחד, מערבלים אותו דבר כדי להבטיח ערבוב נכון. לאחר מכן סובבו את התערובת וחברו שני מיקרוליטרים של תערובת האב לכל צינור של 0.2 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 0.4 מיקרוליטר של פלסמיד cDNA/ORF 0.019 מיקרומולרי לכל צינור.

לדגור על תגובות מחשוף ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בתגובת המבחנה הבאה, שלב שני, המשך להחדיר מודול UAS ספציפי לווקטור לתוך פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים Cas9 המתקבלים. כדי להגדיר את תגובת הצעד הבודד של 1.4 מיקרוליטר עבור כל דגימה, סדרו את צינורות ה-0.2 מיליליטר המסומנים בבלוק קירור אלומיניום על קרח.

הכן את תערובת האב למספר N של תגובות על ידי ערבוב כמויות מתאימות של מודול כטב"ם ותערובת מאסטר להרכבת תגובה חד-שלבית. מערבבים את התערובת היטב לפני שמסובבים אותה. לאחר מכן aliquot 0.77 מיקרוליטר של תערובת האב לכל צינור.

הוסף 0.7 מיקרוליטר של פלסמיד cDNA/ORF ליניארי Cas9 לאליקוט בכל צינור ודגר על תגובות ב 50 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.

Explore More Videos

CRISPR based Modular Assembly

CRISPRmass

Two step Test Tube Reactions

Cas9 SgRNA

CDNA ORF Plasmids

Vector specific UAS Module

Cas9 Linearized CDNA ORF Plasmids

Single step Reaction Assembly

From the series

בניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בעלת תפוקה גבוהה באמצעות CRISPRmass