כדי להתחיל, להרכיב מיקרוסקופ ניתוח, שני מלקחיים עם קצוות עדינים, מספריים, מחט מזרק מיליליטר, ונייר סינון על פלטפורמת עבודה. לאחר מכן, באמצעות מספריים המרפק, גרעין את העיניים מעכבר מורדם. הכניסו את העיניים לצלחת זכוכית המכילה 4% פאראפורמלדהיד ו-0.2% חומצה פיקרית במאגר פוספט מולארי 0.1.
במיקרוסקופ המנתח, באמצעות מזרק של מיליליטר, מנקבים חור בלימבוס הקרנית וחותכים את המקטע הקדמי במספריים. השתמש במלקחיים כדי להסיר את העדשה משטח הרשתית הפנימית. עכשיו באמצעות שני מלקחיים, בזהירות לקלף את לובן העין עד הרשתית מבודדת לחלוטין מן העין.
לאחר מכן, לחתוך את הרשתית לארבעה חלקים. לאחר קיבוע לילה ותמיסת 4% פרפורמלדהיד, שטפו את רקמות הרשתית ב-PBS טוחנת 0.01 שש פעמים למשך 10 דקות כל אחת. לדגור על רקמת הרשתית בנתרן בורוהידריד 1% ב-PBS טוחנת 0.01 למשך 30 דקות.
שוב, לשטוף את קטעי הרשתית ב PBS טוחנת 0.01 לפחות שש פעמים. לאחר מכן, להסיר את הזגוגית עם נייר פילטר. ובאמצעות סכין גילוח פיפיות, פורסים את הרשתית למקטעים קטנים בין 100 ל -300 מיקרומטר.
שטפו את פסי הרשתית ב-PBS טוחנת 0.01 שש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לפני שתדגרו עליהם עם מגיב A ומגיב B מערכת ABC למשך יומיים. לאחר מכן, שטפו את פסי הרשתית בחיץ תריס מולארי 0.05 שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. יש לדגור מראש על פסי הרשתית עם 5%מגיב 1 ו-5% מגיב 3 מדיאמינובנזן, או ערכת DAB, במים מזוקקים למשך שעה בטמפרטורת החדר.
כדי להכתים את פסי הרשתית עם DAB, הוסף את אותו נפח תמיסה משלושה צינורות בערכת DAB ברצף. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, להתבונן במצב הצביעה. שטפו את רצועות הרשתית עם חיץ טריס טוחנת 0.05 שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת.
לבסוף, שטפו את הרצועות ב-PBS טוחנת 0.01 שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת. בניסויי ביקורת, פדיקור חרוט עם שני סרטים וכדורי מוט עם סרט אחד לא הראו תגובתיות חיסונית בהיעדר נוגדנים ראשוניים. חלבון קינאז C אלפא זיהה תאים דו קוטביים מוט ברשתית.
מעמד DAB מציג את נוכחותם של חלבון קינאז C אלפא ודנדריטים של תאים דו קוטביים, היוצרים סינפסות עם קצות מוט וחרוט בשכבת הפרספקס החיצונית. בנוסף, מוצר תגובת DAB מסייע בזיהוי הדקי תאים דו-קוטביים מוט ותהליכים אקסונליים בשכבת הפרספקס הפנימית. תאים אמקריניים בעלי תגובתיות חיסונית של חומר P הוכחו כפרה-סינפטיים לתאי אמקרין שליליים של חומר P.
יתר על כן, תאי החומר P immunoreactivity amacrine היו פוסט-סינפטיים עד דו-קוטביים בתת-שכבה שלוש ותת-שכבה חמש של שכבת הפרספקס הפנימית, בהתאמה.
